水稻ABA8’‑羟化酶OsABA8ox1基因编码序列及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体为水稻ABA8’‑羟化酶

【技术实现步骤摘要】
水稻ABA8’-羟化酶OsABA8ox1基因编码序列及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及在水稻中表达的OsABA8ox1基因编码序列及其应用。具体包括：ABA8’-羟化酶基因OsABA8ox1的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及在水稻Zhonghua11中获得Tilling突变体，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。
技术介绍
高等植物中，植物激素ABA的含量由其合成和分解反应调控并达到平衡(NambaraandMarion-Poll,2005)。调控ABA产量的关键酶包括参与清除叶黄素的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCEDs)(Tanetal.,2003),将玉米黄质通过花药黄质转变为紫黄质的玉米黄质环氧化酶(ZEP)(Oliveretal.,2007),以及参与ABA合成最后一步的ABA醛氧化酶(AAO3)(Yangetal.,2014)。ABA8’-羟化酶催化了将ABA氧化为红花菜豆酸(PA)的反应,水稻中有三种基因编码该酶(OsABA8ox1,2and3)(Saikaetal.,2007)。ABA对于植物胁迫相应以及发育调控都有重要作用，包括种子休眠与成熟，器官脱落以及叶片衰老等(ChandlerandRobertson,1994;Cutleretal.,2010；BeckerandApel,1993)。ABA会诱导一些SAGs的表达,如NYC1(Kusabaetal.,2007),SGR(Parketal.,2007),PPH(Schelbertetal.,2009)以及PaO(Pruzinskáetal.,2005),从而促进植物衰老。ABA处理后一些NAC转录因子有显著上调,包括VNI2(Yangetal.,2011),SNAC-As(Takasakietal.,2015),ORE1(Kimetal.,2011),以及OsNAP(Liangetal.,2014)，但其背后的分子机制尚不明确。AtNAP可以特异性地结合AAO3的启动子，从而促进叶绿素降解基因的转录(Yangetal.,2014)。尽管关于ABA的生物合成通路、下游信号机制以及对叶片衰老的诱导已经有许多研究，但上游的转录调控网络以及与叶片衰老联系的机制尚不明确。OsABA8ox1是ABA降解代谢过程中最重要的酶之一，也影响了植物抗旱能力，从而影响结实率与产量。ABA由类胡萝卜素通路产生的前体在细胞质中合成，之后被ABA羟化酶催化失活。内源性ABA的积累受到其合成与分解反应的调控，而ABA8ox酶的活性就是重要的影响因素。目前已经发现在玉米中ABA8ox基因在各个器官均有表达，且在干旱胁迫下，对于玉米根中ABA的分解有重要调控作用。在其他谷类作物中也有对ABA8ox基因家族成员进行相关的进化与功能的分析。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种新的水稻基因，还提供该水稻基因的蛋白编码序列，并提供该水稻基因的应用。本专利技术提供的水稻中表达的ABA8′-羟化酶基因OsABA8ox1的序列及其应用，具体包括：OsABA8ox1基因的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及基于水稻Zhonghua11获得Tilling突变体，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。本专利技术通过克隆水稻中编码ABA8′-羟化酶的基因OsABA8ox1，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，结果显示基因在根以及二叶、三叶中表达量偏少，在五叶中表达量较高。在接受ABA激素处理后，OsABA8ox1的表达量显著下降，在24h达到最低；盐胁迫处理8-2h后，表达量显著升高；干旱处理2h后，OsABA8ox1的表达量显著下降，此后有所波动，但总体呈下降趋势。在基于水稻Zhonghua11的OsABA8ox1突变体中，观察到突变体株系株高变矮，千粒重、结实率偏低，以及对黑暗处理的敏感程度升高，衰老加快，这为水稻中ABA在其衰老过程中发挥的作用以及如何利用该效应提高产量提供了基因来源与技术支持。本专利技术首先从水稻中克隆出一种编码ABA8′-羟化酶的基因，命名为OsABA8ox1。为具有特定序列的DNA分子，其中开放阅读框为1416bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供这种水稻OsABA8ox1蛋白编码序列，有471个氨基酸残基，分子量52.93kDa，等电点为9.65，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供用于调取获得水稻样品中基因OsABA8ox1的一对核苷酸引物。该引物根据基因OsABA8ox1设计，使用此对引物对水稻样品cDNA进行PCR扩增可获得长1416bp的基因片段。具体的引物序列为：ForwardPrimer：5'ATGGGTGCTTTTCTTCTGTTCGTGT3'（SEQIDNO.3）ReversePrimer：5'TCACTCCTGCTCGGTGTTCTTGCGG3'（SEQIDNO.4）。本专利技术还供检测水稻基因OsABA8ox1在不同器官表达模式的方法，即利用所述基因OsABA8ox1的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列：ForwardPrimer：5'CCAAGAACCCCAACGTGTTC3'（SEQIDNO.5）ReversePrimer：5'CGGGCTGGACACCATCA3'（SEQIDNO.6），对水稻cDNA样品进行Real-timePCR,然后检测该基因在茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：（1）提取水稻器官的总RNA（Trizol，市售）；（2）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA，根据SEQIDNO.5和SEQIDNO.6设计引物，根据SEQIDNO.1，跨越ORF区和3`UTR的100bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。本专利技术还提供检测水稻基因OsABA8ox1在高盐、干旱胁迫以及激素处理下的表达模式变化的方法，即将水稻进行高盐、干旱胁迫以及激素处理后，提取水稻叶片中的RNA；利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用引物SEQIDNO.5与SEQIDNO.6，进行定量PCR检测。其步骤如下：（1）将两周大的水稻苗置于150μM氯化钠溶液中，28℃培养1d以进行高盐胁迫处理；置于20µMABA中，28℃培养24h以进行激素处理；置于干燥空气中，28℃培养1d、以进行干旱胁迫处理；置于水中，28℃培养1d作为对照；（2）提取前述个处理的水稻苗的叶和根中的总RNA（Trizol，市售）；（3）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA，根据SEQIDNO.5和SEQIDNO.6设计引物，根据SEQIDNO.1，跨越ORF区和3`UTR的100bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。本专利技术还提供检测OsABA8ox1突变体的水稻与野生型水稻（Zhonghua11）对黑暗胁迫敏感程度、衰老速度以及产量差异的方法，其步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的基因，记为

【技术特征摘要】
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的基因，记为OsABA8ox1，全长2865bp，其中开放阅读框为1416bp，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.一种如权利要求1所述的基因OsABA8ox1编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码471个氨基酸残基，分子量52.93kDa，等电点为9.65，氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.一对用于调取获得水稻样品中基因OsABA8ox1的引物序列，其特征在于，根据权利要求1所述基因OsABA8ox1设计，序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。4.一种检测水稻基因OsABA8ox1mRNA表达模式的方法，其特征在于，利用权利要求1所述DNA分子的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列见SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，对水稻cDNA样品进行Real-timePCR，然后检测该基因在茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得c...

【专利技术属性】
技术研发人员：明凤，丁佳琳，毛婵娟，卢松冲，吕波，罗莉琼，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31