毛白杨PtoWRKY40基因、其表达载体和构建方法以及应用技术

本发明专利技术提供了毛白杨PtoWRKY40基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术利用PtoWRKY40基因、植物表达载体以及RNAi中间载体构建了融合表达载体，获得了转基因植物。针对其木材品质性状的测试表明，该基因的转入可以有效改良树木的材性。

【技术实现步骤摘要】
毛白杨PtoWRKY40基因、其表达载体和构建方法以及应用
本专利技术涉及生物
，具体地说，本专利技术涉及一种来源于速生且木材品质优良的毛白杨(PopulustomentosaCarr.)的WRKY转录因子基因，命名为PtoWRKY40。本专利技术还涉及PtoWRKY40基因编码的蛋白，利用PtoWRKY40基因和植物表达载体pBI121以及RNAi中间载体pCR2.1构建的融合表达载体，以及利用该基因培育优良木材品质的转基因植物的方法。
技术介绍
杨树树形高大、生长周期短，具有重要的经济价值和生态价值，在我国是一个重要的短轮伐期工业用材树种之一，杨树木材品质性状的育种一直是林木育种工作的重点。2002年毛果杨基因组测序工作的顺利完成，加快了树木基因分离和应用的研究。一些与木材性状相关基因的陆续被发现、克隆和功能验证，为从基因水平上改善林木材性奠定了基础。然而，目前对于如何通过基因工程手段从基因水平上改善林木特别是杨树的材性仍然是一个亟需解决的技术难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的一个目的是提供一种能够有效改良树木材性的毛白杨PtoWRKY40基因。通过对该基因的应用，有利于改良杨树木材的品质，提高以该木材为原料生产的产品的质量。本专利技术提供了一种毛白杨(PopulustomentosaCarr.)PtoWRKY40基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供了一种基于上述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述毛白杨PtoWRKY40基因。本专利技术还提供了一种细胞，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含上述表达载体的细胞。本专利技术还提供了一种包含上述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体的构建方法，包括如下步骤：A、分离和克隆毛白杨PtoWRKY40基因；B、将步骤A所述的毛白杨PtoWRKY40基因连接到pGEM-TEasy载体中，得到连接产物PGEM-PtoWRKY40；C、将步骤B所得的连接产物PGEM-PtoWRKY40用特异的正向、反向引物进行扩增，对扩增产物和RNAi中间载体pCR2.1分别进行XbaI/XhoI和SpeI/SacI双酶切后，连接得到RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40,对所述RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40与植物表达载体pBI121分别进行XbaI/SacI双酶切后，连接得到双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40；以及D、将所述双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。本专利技术还提供了一种利用上述毛白杨PtoWRKY40基因获得转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、构建包含上述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体；B、用构建的所述表达载体转化植物细胞；以及C、将被转化的所述植物细胞培育成转基因植物。本专利技术还提供了一种上述毛白杨PtoWRKY40基因在改良树木材性方面的应用。基于此，本专利技术的突出优点在于：本专利技术提供一种能够有效改良树木材性的基因PtoWRKY40。通过对该基因的应用，有利于增加转基因植株的木质部、韧皮部和形成层的宽度，增加节间均长，并且提高木质素含量、木材密度以及生物量，改善以该木材为原料生产的产品的质量。附图说明图1.RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40构建图；图2.RNAi表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40构建图；图3.转入生根培养基的PtoWRKY40转基因杨树植株；图4.移栽的PtoWRKY40转基因84K银腺杨植株和对照植株；图5.PtoWRKY40转基因84K银腺杨植株的PCR检测；图6.PtoWRKY40转基因84K银腺杨及其对照植株的PtoWRKY40和木材次生壁发育相关基因的荧光实时定量PCR分析；图7.PtoWRKY40转基因84K银腺杨及其对照植株的茎横切面解剖特征汇总图；图8.PtoWRKY40转基因84K银腺杨及其对照植株的茎横切面解剖结构。具体实施方式本专利技术提供了一种来源于毛白杨的WRKY的同源基因PtoWRKY40基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。WRKY是一类重要的转录因子，参与抗病、响应低温和干旱胁迫、ABA信号转导、叶片衰老以及毛状体和种子发育等反应(Xuetal.,2016；Songetal.,2016；Sarrisetal.,2015；Logemannetal.,2013；Birkenbihletal.,2012)。本专利技术还提供了一种基于上述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述毛白杨PtoWRKY40基因。优选地，所述表达载体包含RNAi中间载体和植物表达载体；优选地，所述RNAi中间载体为pCR2.1，所述植物表达载体为农杆菌载体或用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体，更优选地，所述植物表达载体为pBI121、pBI221或pCAMBIA3301。优选地，所述表达载体还包含启动子，所述启动子至少包括以下其一：花椰菜花叶病毒(CaMV35S)、Actin和Ubiqutin启动子，所述启动子单独或与其它植物启动子结合使用。本专利技术还提供了一种细胞，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含上述表达载体的细胞。优选地，所述宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。本专利技术还提供了一种包含上述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体的构建方法，包括如下步骤：A、分离和克隆毛白杨PtoWRKY40基因；B、将步骤A所述的毛白杨PtoWRKY40基因连接到pGEM-TEasy载体中，得到连接产物PGEM-PtoWRKY40；C、将步骤B所得的连接产物PGEM-PtoWRKY40用特异的正向、反向引物进行扩增，对扩增产物和RNAi中间载体pCR2.1分别进行XbaI/XhoI和SpeI/SacI双酶切后，连接得到RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40,对所述RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40与植物表达载体pBI121分别进行XbaI/SacI双酶切后，连接得到双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40；以及D、将所述双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。本专利技术还提供了一种利用上述毛白杨PtoWRKY40基因获得转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、构建包含所述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体；B、用构建的所述表达载体转化植物细胞；以及C、将被转化的所述植物细胞培育成转基因植物。优选地,当所述植物为单子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：水稻、小麦、牧草及玉米；当所述植物为双子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：杨树、拟南芥、油菜及烟草。优选地,所述植物细胞为84K银腺杨细胞。优选地，所述表达载体通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、基因枪的方式导入所述植物细胞。本专利技术还提供了一种上述毛白杨PtoWRKY40基因在改良树木材性方面的应用。优选地,所述树木为杨树。下面结合具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毛白杨(Populus tomentosa Carr.)PtoWRKY40基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种毛白杨(PopulustomentosaCarr.)PtoWRKY40基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种基于权利要求1所述毛白杨PtoWRKY40基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的毛白杨PtoWRKY40基因。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含RNAi中间载体和植物表达载体pBI121；优选地，所述RNAi中间载体为pCR2.1，所述植物表达载体为农杆菌载体或用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体，更优选地，所述植物表达载体为pBI121、pBI221或pCAMBIA3301；优选地，所述表达载体还包含启动子，所述启动子至少包括以下其一：花椰菜花叶病毒(CaMV35S)、Actin和Ubiqutin启动子，所述启动子单独或与其它植物启动子结合使用。5.一种细胞，其特征在于，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含权利要求3所述的表达载体的细胞。6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌或农杆菌细胞。7.一种权利要求4所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：A、分离和克隆如权利要求1所述的毛白杨PtoWRKY40基因；B、将步骤A所述的毛白杨PtoWRKY40基因连接到pGEM-TEasy载体中，得到连接产物PGEM-PtoWRKY40；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李少锋，卢孟柱，胡建军，赵树堂，辛学兵，夏永秀，李建波，孙丽芳，高旭，刘学，王然，褚洋，刘亮，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院华北林业实验中心，
类型：发明
国别省市：北京,11