参与植株侧生器官及花发育的白桦SEP1基因及其蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一个多项功能的白桦BpSEP1基因及其蛋白，属于分子生物学中的基因技术领域，其特征在于参与调控植物多个生长发育过程。BpSEP1基因的序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术提供BpSEP1基因并用于构建其植物表达载体，构建的表达载体经农杆菌浸染拟南芥，发现部分转基因植株侧枝着生的托叶为对生叶，侧枝为单向分支；部分转基因植株花序停止发育；此外转基因植株开花时间略微提前。本发明专利技术为今后利用转基因技术对E类基因在侧生器官建成及花器官发育过程中更多功能的获取与分析做出铺垫，同时为调控白桦花发育提供基因资源与理论依据，具有很大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
参与植株侧生器官及花发育的白桦SEP1基因及其蛋白
：本专利技术涉及一个参与植株侧生器官建成及花发育的白桦BpSEP1基因及其蛋白,属于分子生物学中的基因

技术介绍
：通过对拟南芥(Arabidopsisthaliala)、矮牵牛(Petuniahvbrida)和金鱼草(Antirrhinummajus)等模式植物的研究，人们提出了花器官发育的ABC模型，即控制花结构的基因(绝大多数为MADS盒基因)按功能可划分为ABC三大类，同一组基因控制相邻2轮器官的发育；同时指出A、C组基因互相抑制，其表达受到花序分生组织特异基因的上位调节；B组基因以自主调节方式控制自身的表达，它与A、C组基因的表达相互独立；C组基因通过与其它基因的相互作用调节其在4轮花器官结构中的时空表达。随着研究的深入，人们在寻找与ABC类基因相互作用的蛋白时发现了花器官发育的E类基因-SEPALLATA(SEP)基因。该基因在花器官发育中不可或缺，参与整个花分生组织的发育过程。有研究发现在拟南芥SEP1、SEP2和SEP3的三突变体中，各轮花器官均转变为萼片，说明它们决定了另外三轮花器官既花瓣、雄蕊和心皮的形态建成，而且这3个基因在功能上是冗余的，这暗示了它们除了在拟南芥花发育早期特异性表达之外，还在各轮花器官的发育过程具有空间特异性。E类基因功能的揭示使ABC模型在内容上得到极大补充。近年来，为阐释ABCE四类基因所编码的蛋白产物如何通过相互作用来控制花器官的特征属性，科学家们提出了四聚体模型(quartetmodel)。该模型认为：高等植物四轮花器官的发育是由A、B、C和E类基因的蛋白质产物所形成的四聚体决定的。在拟南芥中，结合酵母双杂交结果，人们发现：AP1+AP1+SEP+SEP(A类+E类基因)决定萼片的形成，AP1+AP3+PI+SEP(A类+B类+E类基因)决定了花瓣的发育，AP3+PI+AG+SEP(B类+C类+E类基因)决定雄蕊的发育，AG+AG+SEP+SEP(C类+E类基因)决定了心皮(雌蕊)的发育。该模型的提出将花器官建成的研究转向整体解析诸多花器官决定因子之间的协同相互作用，并以此来解释控制花器官发育的作用机制。由此可知，以SEP基因为代表的E类基因与ABC模型中的成员A、B、C三类基因的共同表达对于高等植物花器官特性的建成与维持是必不可少的。此外白桦(BetulaplatyphyllaSuk)花单性，雌雄同株，花器官高度退化，是典型的不完全花。同年生雌雄花花期不遇，且雄花发育过程中存在着越冬宿存现象，这些均与拟南芥、金鱼草和矮牵牛等模式草本植物花的发育模式有着显著差异，这可能是由多年生木本植物特有的控制花器官发育的下游基因与调控系统所造成的，因此，深入研究其发育机制对于高等植物的花发育机制具有着重要的意义。本研究以白桦雌雄花为材料，克隆分离了白桦SEP1基因的全长编码序列，利用实时定量PCR技术研究白桦SEP1基因的组织表达特征，并将其过表达转化拟南芥，观察转基因植株的差异表型，试图研究白桦这一特殊物种中E类基因在高等植物花器官发育过程中发挥的功能和作用，也可为E类基因在其他木本植物花器官发育过程中发挥的重要作用做出合理的预测。
技术实现思路
：本专利技术提供一种从白桦中克隆白桦花发育相关基因BpSEP1的方法：(1)先采用改良的CTAB-LiCl法提取白桦花序总RNA，经过DNaseI消化和纯化后，按照TaKaRa公司RNAPCRKit(AMV)试剂盒的方法合成cDNA的第一链。(2)5'RACE和3'RACE按照TaKaRa公司试剂盒说明书进行。再将PCR的扩增产物进行胶回收，回收目的片段与T载体连接，转化大肠杆菌，然后测序。(3)将5'RACE和3'RACEPCR获得的序列进行拼接后，利用引物SEP1-F1和SEP1-R1进行PCR检测，检测正确后，所获得的全长cDNA，命名为白桦BpSEP1；其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。本专利技术构建了白桦BPSEP1基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pROKII-BpSEP1)经农杆菌浸染拟南芥植株，获得转基因拟南芥植株；其中转基因纯系植株表型有明显变化，如部分转基因植株侧枝着生的托叶的位置发生变化，呈现为对生叶，以及侧枝呈现为单向分支，部分转基因植株花的形态出现异常，花序不再进行发育；暗示BpSEP1基因既在侧生器官发育过程中产生影响也在花器官的发育过程中起到调控作用，此外转基因拟南芥的开花时间与野生型相比也略微提前。构建白桦BpSEP1基因植物表达载体的技术方案如下：选择pROKII载体作为基本植物表达载体，首先分别设计含XbaI和SacI识别序列的引物SEP1-a和SEP1-b，扩增白桦SEP1全长编码序列，并克隆至pMD19重组为pMD19-SEP1，利用限制性内切酶XbaI和SacI分别对pMD19-SEP1和pROKII进行双酶切，酶切产物分别回收用T4DNA连接酶连接，并转化DH5α，通过菌液PCR和酶切以及测序鉴定构建的载体pROKII-SEP1。本专利技术提供的白桦BpSEP1基因在调节拟南芥侧生器官发育以及花器官发育，促进提前开花的应用。将上述植物表达载体pROKII-BpSEP1转化农杆菌EHA105，经农杆菌介导的浸花法浸染，获得白桦BpSEP1过表达的转基因拟南芥植株；其中白桦BpSEP1部分转基因植株表现出托叶着生位置异化、侧枝呈现单向分支，以及早花等表型，暗示BpSEP1可能影响了高等植物的光周期调控系统与下游基因的表达，也表明了SEP类基因在各个物种中存在功能的差异性。此外转基因植株的花器官形态异常，如花蕾膨大、花不开放而结果、花萼轻微呈现为花瓣状并且花序不再进行发育等，这与其他植物的SEP类基因功能相符，证明了SEP基因在各个物种中功能的保守性。本专利技术为今后利用转基因技术对E类基因在花器官发育过程中更多功能的获取与分析做出铺垫，同时为利用基因工程技术调控白桦花发育提供基因资源与理论依据，具有很大的应用价值。本专利技术与现有的技术相比具有如下有益效果：1、本专利技术提供的含有白桦BpSEP1基因重组载体，可参与调控植物侧生器官发育花及器官的发育2、本专利技术提供了调控植物花发育的BpSEP1蛋白，可用于调控植物与开花相关的光周期，并且可用于搜寻在其他植物中与花发育相关的基因。3、本专利技术提供的BpSEP1基因促进植物提前开花，可用于林木植物花发育研究中，并为植物SEP基因功能研究提供参考资源。附图说明图1为pROKII-BpSEP1植物表达载体构建图谱图2为植物表达载体RT－PCR扩增产物电泳结果图3为白桦BpSEP1基因的ORF序列及相应氨基酸序列，MADS和K结构域分别用单、双线标记图4为白桦BpSEP1基因与部分拟南芥、金鱼草的MADS-box基因的系统进化树分析图5为白桦BpSEP1基因在白桦不同组织器官中的表达图6为转基因过表达白桦BpSEP1拟南芥PCR检测图7为转基因过表达白桦BpSEP1拟南芥表型观察图8为BpSEP1cDNA全长克隆引物。具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个参与植株侧生器官建成及花发育的白桦BpSEP1基因及其蛋白，其特征在于侧枝着生的托叶的位置发生变化，呈现为对生叶，以及侧枝呈现为单向分支，此外部分转基因植株花的形态出现异常，花序不再进行发育，开花时间略微提前。BpSEP1基因的序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一个参与植株侧生器官建成及花发育的白桦BpSEP1基因及其蛋白，其特征在于侧枝着生的托叶的位置发生变化，呈现为对生叶，以及侧枝呈现为单向分支，此外部分转基因植株...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘雪梅，田晶，朱德财，张勇，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23