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斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用制造技术

技术编号:17770269 阅读:76 留言:0更新日期:2018-04-21 23:01
本发明专利技术属于基因工程技术领域,具体公开了一种斜带石斑鱼

【技术实现步骤摘要】
斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用
本专利技术涉及基因工程
,具体地,涉及一种斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用。
技术介绍
在机体的代谢调节过程中,胰岛素(insulin)起着重要的调控作用。胰腺一直被认为是胰岛素的重要产生器官,但最近的研究表明胰腺以外的其他器官也能够分泌胰岛素,胰岛素作为重要的激素,在机体的生长、细胞分化以及代谢方面发挥重要的功能。鱼类的胰岛素作为最早被发现的胰岛素的一种,在鱼类的摄食、生长、发育和糖脂代谢调节等多方面都发挥重要作用。胰岛素与受体结合后能够通过PI3K/Akt,ERK和STAT/Jak–STAT信号通路来引发下游多种的生物学功能。石斑鱼属鮨科(Serranidae),石斑鱼属(Epinephelus),为暖水性的大中型海产鱼类。石斑鱼营养丰富,肉质细嫩洁白,类似鸡肉,素有“海鸡肉”之称。石斑鱼又是一种低脂肪、高蛋白的上等食用鱼,被港澳地区推为我国四大名鱼之一,是高档筵席必备之佳肴。目前石斑鱼的饲料还是以动植物蛋白作为主要添加剂,然而动植物蛋白成本较高,如果能够提高石斑鱼对糖脂的利用,对生产成本会有很大的降低。但是,目前在石斑鱼人工养殖中尚未见利用insulin蛋白作为一种有效促进斜带石斑鱼对糖脂利用的饵料添加剂或促生长剂的报道。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足,提供一种斜带石斑鱼insulin基因。本专利技术的另一目的在于提供一种斜带石斑鱼insulin蛋白。本专利技术的另一目的在于提供一种含有斜带石斑鱼insulin基因的表达载体。本专利技术的另一目的在于提供上述表达载体转化的大肠杆菌重组菌株。本专利技术的另一目的在于提供利用上述大肠杆菌重组菌株生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种由上述方法制备得到的重组斜带石斑鱼insulin蛋白及其在制备海水鱼类促生长剂或饵料添加剂中的应用。为了实现上述目的,本专利技术是通过以下方案予以实现的:一种斜带石斑鱼insulin基因,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。一种斜带石斑鱼insulin蛋白,其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术首次克隆了斜带石斑鱼的insulin基因,并得到了3’UTR和部分5’UTR。克隆的方法是常规的基因克隆方法,利用同源物种的基因比对设计简并引物,经过PCR后得到中间片段,然后根据中间片段的序列分别设计两个5’RACE的下游引物和两个3’RACE的上游引物,再利用通用引物AAP和AUAP进行5’和3’嵌套PCR得到了insulin的ORF、5’UTR和3’UTR。最后设计克隆ORF的引物,PCR后把得到目的基因连接到PCR2.1载体上,即得到PCR2.1-insulin;基因测序后获得斜带石斑鱼insulin基因的核苷酸序列,如SEQIDNO:1所示。一种含有上述斜带石斑鱼insulin基因的表达载体,所述表达载体可以是任意一种可高效表达斜带石斑鱼insulin基因的载体。优选地,所述表达载体为大肠杆菌表达载体。更优选的,所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET22b-insulin。本专利技术构建的含有斜带石斑鱼insulin基因的大肠杆菌表达载体pET22b-insulin,是利用上述载体PCR2.1-insulin为模板,通过PCR方法合成带有酶切接头的斜带石斑鱼insulin基因,经酶切和分离纯化后,接入到已有的载体pET22b的相应酶切位点(即EcoRI和NotI)之间,即构建成所需的含有斜带石斑鱼insulin基因的表达载体pET22b-insulin。一种包含上述表达载体的重组菌株。优选地,所述菌株为大肠杆菌重组菌株pET22b-insulin-BL21;该菌株能高效表达重组斜带石斑鱼insulin蛋白;该菌株是由上述含有斜带石斑鱼insulin基因的表达载体pET22b-insulin转化大肠杆菌BL21而得到的菌株,命名为pET22b-insulin-BL21。斜带石斑鱼具有重大的经济价值,采用常规的基因工程技术,可利用上述含有斜带石斑鱼insulin基因的大肠杆菌重组菌株pET22b-insulin-BL21,大量生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白。另外,本专利技术还提供一种利用上述大肠杆菌重组菌株生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白的方法,包括如下步骤:将上述大肠杆菌重组菌株接种在LB液体培养基中,于37℃、转速200转/分条件下培养至OD600值达到0.5~0.8,然后加入IPTG至终浓度为1mM,于37℃、转速200转/分条件下培养4h后,经5000×g离心10min收集菌体,超声破碎后经12000×g离心10min收集上清,经分离纯化得到重组斜带石斑鱼insulin蛋白。本专利技术还请求保护由上述方法制备得到的重组斜带石斑鱼insulin蛋白;所述蛋白可提高海水鱼类对糖脂的利用,促进海水鱼类的生长。本专利技术还请求保护上述insulin蛋白或重组斜带石斑鱼insulin蛋白在制备海水鱼类促生长剂和/或饵料添加剂中的应用。一种促进海水鱼类生长的药剂和/或饲料,含有上述斜带石斑鱼insulin蛋白或重组斜带石斑鱼insulin蛋白。与现有技术相比,本专利技术具有以下有益效果:本专利技术首次克隆获得斜带石斑鱼insulin基因,并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株,利用重组大肠杆菌菌株在体外获得大量表达的重组斜带石斑鱼insulin蛋白,经研究该蛋白能显著抑制糖异生相关基因G6P和PEPCK的表达、显著促进脂肪合成相关基因ACC1和FAS的基因表达、显著促进生长相关基因IGFI和IGFII的基因表达,即该蛋白能促进斜带石斑鱼等海水鱼类对糖脂的利用和生长,可以用于制备适合海水鱼类使用的促生长剂或饵料添加剂,减少动植物蛋白的使用,降低生产成本。附图说明图1为实施例1中以斜带石斑鱼布氏体的反转录cDNA为模板进行PCR扩增insulin中间片段产物的凝胶电泳分析图;其中泳道M为Marker,泳道1为PCR扩增产物,泳道NC为阴性对照。图2为实施例1中5'RACE和3'RACE的PCR电泳图;A为5'RACE第一轮产物的凝胶电泳图,其中泳道M为Marker,泳道1、2、3为PCR扩增产物,泳道NC为阴性对照;B为5'RACE第二轮产物的凝胶电泳图,其中泳道M为Marker,泳道1、2、3为PCR扩增产物,泳道NC为阴性对照;C为3'RACE第一轮产物的凝胶电泳图,其中泳道M为Marker,泳道1、2、3为PCR扩增产物,泳道NC为阴性对照;D为3'RACE第二轮产物的凝胶电泳图,其中泳道M为Marker,泳道1、2、3为PCR扩增产物,泳道NC为阴性对照;E为克隆insulinORF的产物的凝胶电泳图,其中泳道M为Marker,泳道1、2、3为PCR扩增产物,泳道NC为阴性对照。图3:A为实施例2中带酶切位点insulin的PCR扩增凝胶电泳分析图,其中泳道M为Marker,泳道1为PCR扩增产物,泳道NC为阴性对照;B为实施例2中表达载体pET22b-insulin的酶切鉴定凝胶电泳分析图,其中泳道M为Marker,泳道1为pET22b-insulinEcoRI和NotI双酶切,泳道2为pET22b-insulin未酶切。图4本文档来自技高网...
斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用

【技术保护点】
一种斜带石斑鱼

【技术特征摘要】
1.一种斜带石斑鱼insulin基因,其特征在于,所述insulin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种斜带石斑鱼insulin蛋白,其特征在于,所述insulin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种表达载体,其特征在于,含有权利要求1所述的斜带石斑鱼insulin基因。4.根据权利要求3所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体为pET22b-insulin。5.一种重组菌株,其特征在于,所述重组菌株是由权利要求4所述的表达载体pET22b-insulin转入大肠杆菌BL21中所形成的大肠杆菌重组菌株pET22b-insulin-BL21。6.一种利用权利要求5所述大肠杆菌重组菌株生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:将权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员:李文笙杨国坤
申请(专利权)人:中山大学
类型:发明
国别省市:广东,44

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