一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用，涉及三疣梭子蟹基因工程，该三疣梭子蟹新型Crustin基因序列如SEQ NO.1所示，本发明专利技术还提供一种制备三疣梭子蟹新型Crustin基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹新型Crustin基因重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白；与现有技术相比，本发明专利技术具有如下优点：Crustin基因的重组蛋白可能广泛参与了三疣梭子蟹抗微生物感染的先天免疫反应，在微生物新药物开发上显示出诱人的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种三疣梭子蟹新型Crustin基因及其重组蛋白的应用。
技术介绍
抗菌肽是广泛存在于生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体固有免疫的关键因子之一。Steiner最早在天蚕中发现后，到目前为止，在各种生物中总共发现了800多种抗菌肽。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类：(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如鲎的血蓝蛋白。Crustin作为一种针对革兰氏阳性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中发现的(Relfetal.1999)。随后的研究发现其氨基酸序列在其C末端有12个Cys，其中8个位置保守，形成WAP结构域。三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。但随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的多种疾病在三疣梭子蟹养殖群体中频频爆发，造成了巨大的经济损失，严重制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。目前蟹病的防治仍主要采用传统抗生素药物防治，但长期盲目滥用药物，容易造成耐药性等问题，导致产品质量下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。Crustin作为一种重要的抗菌肽在其免疫防御中发挥着非常重要的作用。因此，这就迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物进行免疫防治。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹新型的Crustin基因。本专利技术所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种制备三疣梭子蟹新型Crustin基因的重组蛋白。本专利技术所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹新型Crustin基因重组蛋白的应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：该三疣梭子蟹新型Crustin基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹新型Crustin基因的序列如SEQNO.1所示。进一步地，所述的三疣梭子蟹新型Crustin基因的氨基酸序列为MetThrSerLeuArgIleAlaPheLeuValLeuValGlyCysValValProAlaTyrMetGlnPheGlySerAsnCysValHisTrpCysArgThrProGluAsnGlnValTyrCysCysLysAspThrHisAspThrProAlaSerProIleGlnValValAsnHisGlyArgCysProProValArgProValCysProProValArgSerPheSerProProGlnSerCysSerSerAspSerAspCysTyrGlyGlnLysCysCysTyrAspArgCysLeuGluGluHisValCysLysProGlnHisTyrGlyHisGlyGlyHisGlyGlyHisGlyGlyHisGlyGlyHisGlyGlyPheGlyGlyPheGlyGlyGlyPheGlyArg。本专利技术为解决第二个技术问题提供了一种制备上述的三疣梭子蟹新型Crustin基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹新型Crustin基因重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即三疣梭子蟹新型Crustin基因重组蛋白。进一步地，在所述步骤(1)中的表达载体选用pET-21a(+)。进一步地，在所述步骤(2)中，所述宿主细胞为大肠杆菌Origami(DE3)。本专利技术利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从中华绒螯蟹中克隆到新型Crustin基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码Crustin成熟肽的基因片段并将其克隆到pET-21a(+)表达载体中，在大肠杆菌Origami(DE3)实现体外重组表达。本专利技术为解决第三个技术问题提供了一种利用上述的三疣梭子蟹新型Crustin基因在制备抑菌药中的应用。本专利技术为解决第三个技术问题提供了一种利用上述的三疣梭子蟹新型Crustin基因在制备动物饲料抗菌添加剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术在分离出的三疣梭子蟹新型Crustin基因的基础上，根据三疣梭子蟹Crustin基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得三疣梭子蟹Crustin的抗菌肽，该抗菌肽具有广谱的抗菌活性，表明三疣梭子蟹Crustin的抗菌肽可能广泛参与了三疣梭子蟹抗微生物感染的先天免疫反应，重组蛋白在动物饲料添加剂和抗病原微生物新药物开发上显示出较好的应用前景。具体实施方式以下通过结合序列表及实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术中的三疣梭子蟹Crustin的cDNA序列克隆及体外重组表达包括下列步骤：a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；b)三疣梭子蟹cDNA文库构建；c)三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及Crustin基因片段的筛选；e)EST序列拼接获得Crustin的全序列；f)三疣梭子蟹Crustin的体外重组表达及活性分析。具体操作如下：1、三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化：利用Invitrogen公司的Trizol试剂从感染了溶藻弧菌的三疣梭子蟹血淋巴中提取总RNA，利用QIAGEN公司的OligotexmRNA纯化试剂盒纯化mRNA。2、三疣梭子蟹cDNA文库构建：利用Stratagene公司cDNASynthesisKit和ZAP-SynthesisKit(Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoRI接头连接、EcoRI末端磷酸化、XhoI内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEXIIAgaroseGelExtractionKit对大于100bp的酶切片段进行回收，与Invetrogen公司Uni-ZAPXRvector载体连接，利用Stratagene公司的ZAP-IIIGoldCloningKit试剂盒进行文库包装，利用ExassistHelperPhage和SOLR菌株从Uni-XRVector上体外切割pBluescript成为质粒文库。3、三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三疣梭子蟹新型Crustin基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹新型Crustin基因的序列如SEQ NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种三疣梭子蟹新型Crustin基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹新型Crustin基因的序列如SEQNO.1所示。2.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹新型Crustin基因，其特征在于所述的三疣梭子蟹新型Crustin基因的氨基酸序列为：MetThrSerLeuArgIleAlaPheLeuValLeuValGlyCysValValProAlaTyrMetGlnPheGlySerAsnCysValHisTrpCysArgThrProGluAsnGlnValTyrCysCysLysAspThrHisAspThrProAlaSerProIleGlnValValAsnHisGlyArgCysProProValArgProValCysProProValArgSerPheSerProProGlnSerCysSerSerAspSerAspCysTyrGlyGlnLysCysCysTyrAspArgCysLeuGluGluHisValCysLysProGlnHisTyrGlyHisGlyGlyHisGlyGlyHisGlyGl...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶欣悦，母昌考，王春琳，李荣华，宋微微，史策，刘磊，叶央芳，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33