靶向RHO1小GTP结合蛋白并赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子制造技术

本公开内容涉及靶向RHO1小GTP结合蛋白并赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子，具体关注核酸分子及其用于经由RNA干扰介导的对鞘翅目有害生物中靶编码和转录非编码序列的抑制来控制鞘翅目有害生物的使用方法。本公开内容还关注用于生成转基因植物的方法及通过该方法获得的植物细胞和植物，所述转基因植物表达可用于控制鞘翅目有害生物的核酸分子。

【技术实现步骤摘要】
靶向RHO1小GTP结合蛋白并赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子本申请是2011年12月30日提交的申请号为2011800688444(PCT申请号为PCT/US2011/068062)、专利技术名称为“靶向RHO1小GTP结合蛋白并赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子”的专利技术专利申请的分案申请。优先权要求本申请要求2010年12月30日提交的美国临时专利申请流水号61/428,688关于“NucleicAcidMoleculesThatTargettheRHO1SmallGTPBindingProteinandConferResistancetoColeopteranPests”的申请日(filingdate)权益。专利
一般而言，本专利技术涉及对由鞘翅目有害生物(pest)引起的植物损伤的遗传控制。在特别的实施方案中，本专利技术涉及靶编码和非编码序列的鉴定，及重组DNA技术用于转录后阻抑或抑制鞘翅目有害生物细胞中靶编码和非编码序列的表达以提供植物保护效果的用途。专利技术背景西部玉米根虫(westerncornrootworm,WCR)，即玉米根萤叶甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)是北美洲最具破坏性的玉米根虫物种之一，并且是美国中西部玉米生长区的一项特定忧虑。北部玉米根虫(northerncornrootworm,NCR)，即北美玉米根萤叶甲(DiabroticabarberiSmithandLawrence)是一种与WCR共同驻留于大量相同范围的紧密相关物种。存在着作为北美洲重要的有害生物的几种其它相关根萤叶甲属亚种：墨西哥玉米根虫(MCR)，即D.virgiferazeaeKrysanandSmith；南方玉米根虫(SCR)，即D.undecimpunctatahowardiBarber；D.balteataLeConte；D.undecimpunctatatenella；和D.u.undecimpunctataMannerheim。美国农业部目前估计玉米根虫每年造成10亿美元收入损失，包括8亿美元产量损失和2亿美元处理成本。WCR和NCR两者在夏季期间在土壤中以卵沉积。该昆虫遍及整个冬季保持为卵阶段。卵是椭圆的、白色、且长度小于0.004英寸(0.010cm)。幼虫在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵出的精确时机由于温度差异和位置而在各年间有所变化。新孵出的幼虫是白色的蠕虫，其长度小于0.125英寸(0.3175cm)。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫经历三个幼虫龄。在进食几周后，幼虫蜕皮，进入蛹阶段。它们在土壤中化蛹，然后它们在7月和8月中以成虫自土壤出现。成年根虫长度是约0.25英寸(0.635cm)。玉米根虫幼虫在玉米和几种其它禾本科物种上完成发育。黄色狐尾草(yellowfoxtail)上饲养的幼虫较晚出现，并且作为成虫比玉米上饲养的幼虫具有更小的头壳尺寸。Ellsbury等(2005)Environ.Entomol.34:627-34。WCR成虫以暴露的穗尖端的谷粒、玉米穗丝、和花粉为食。若WCR成虫在存在玉米生殖组织前出现，则它们可以以叶组织为食，由此减缓植物生长，且偶而杀死宿主植物。然而，成虫会在优选的穗丝和花粉变得可得到时快速向其转移。NCR成虫也以玉米植物的生殖组织为食，但是比较而言，很少以玉米叶为食。玉米中的大部分根虫损伤通过幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以较细的玉米根毛为食，并且钻入根尖中。随着幼虫生长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在富含玉米根虫时，幼虫进食经常导致自始至终向玉米杆基部修剪根。重度根损伤干扰根将水和营养物转运到植物中的能力，降低植物生长，并且导致降低的谷粒生产，由此经常显著降低总体产量。重度根损伤还经常导致玉米植物的倒伏，其使收获变得更难，而且进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可以导致穗尖端的穗丝修剪。若此“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。可以通过作物轮种、化学杀昆虫剂、生物杀虫剂(例如，孢子形成革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))、或其组合尝试控制玉米根虫。作物轮种遭受对农田的使用放置不想要的限制的重大缺点。此外，一些根虫物种的产卵可以在大豆田间发生，由此降低用玉米和大豆实施的作物轮种的效率。化学杀昆虫剂最严重依赖于实现玉米根虫控制的策略。化学杀昆虫剂用途(尽管)是一种不完美的玉米根虫控制策略；在将化学杀昆虫剂的成本添加到尽管使用杀昆虫剂仍可以发生的根虫损伤的成本时在美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。高幼虫群体、大雨、和不适当的杀昆虫剂应用均可以导致不充分的玉米根虫控制。此外，杀昆虫剂的连续使用可以选择杀昆虫剂抗性根虫品系，以及由于它们中许多对非靶物种的毒性而提高重大的环境忧虑。RNA干扰(RNAi)是一种利用内源细胞途径的方法，由此对足够大小的整个或任何部分靶基因序列特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如，dsRNA分子)导致由其编码的mRNA的降解。在最近几年中，已经使用RNAi在许多物种和实验系统，例如线虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)、植物、昆虫胚胎、和组织培养物中的细胞)实施基因“敲除”。参见例如Fire等(1998)Nature391:806-11；Martinez等(2002)Cell110:563-74；McManus和Sharp(2002)NatureRev.Genetics3:737-47。RNAi经由内源途径，包括DICER蛋白质复合物实现mRNA的降解。DICER将较长的dsRNA分子切割成约20个核苷酸的短片段，称作小干扰RNA(siRNA)。siRNA解开成两个单链RNA：过客链(passengerstrand)和引导链(guidestrand)。过客链受到降解，而引导链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。微小抑制性核糖核酸(miRNA)分子可以类似地掺入RISC中。转录后基因沉默在引导链特异性结合mRNA分子的互补序列并且诱导Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割时发生。尽管在一些真核生物诸如植物、线虫类和一些昆虫中siRNA和/或miRNA的浓度最初是有限的，但已知此过程遍及整个生物体系统性扩散。仅与siRNA和/或miRNA互补的转录物受到切割和降解，如此mRNA表达的敲除是序列特异性的。在植物中，存在DICER基因的几个功能性组。RNAi的基因沉默效应持续数天，并且在实验条件下，可以导致靶定转录物的丰度下降90％或更多，随之发生相应蛋白质的水平降低。美国专利7,612,194和美国专利公开文本No.US2007/0050860,US2010/0192265,和US2011/0154545披露了自玉米根萤叶甲蛹分离的9112种表达序列标签(EST)序列的文库。在美国专利7,612,194和美国专利公开文本No.US2007/0050860中提出将核酸分子与启动子可操作连接以在植物细胞中表达反义RNA，所述核酸分子与其中披露的玉米根萤叶甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的几个特定部分序列之一互补。美国专利公开文本No.US2010/0192265提出将启动子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其包含与异源启动子可操作连接的多核苷酸，其中该多核苷酸包含至少一种选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:87的互补序列；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:88的互补序列；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补序列；SEQ ID NO:90；SEQ ID NO:90的互补序列；SEQ ID NO:137；SEQ ID NO:137的互补序列；SEQ ID NO:138；SEQ ID NO:138的互补序列；至少19个连续核苷酸的片段，其包含全部或部分的SEQ ID NO:88‑90,137,和138中之任一；至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，所述片段包含全部或部分的SEQ ID NO:88‑90,137,和138中之任一；根萤叶甲属(Diabrotica)生物体的天然编码序列，其包含SEQ ID NO:87‑90,137,和138中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQ ID NO:87‑90,137,和138中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，其包含全部或部分的SEQ ID NO:88‑90,137,和138中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，所述片段包含全部或部分的SEQ ID NO:88‑90,137,和138中之任一。...

【技术特征摘要】
2010.12.30 US 61/428,6881.一种分离的核酸分子，其包含与异源启动子可操作连接的多核苷酸，其中该多核苷酸包含至少一种选自下组的核苷酸序列：SEQIDNO:87；SEQIDNO:87的互补序列；SEQIDNO:88；SEQIDNO:88的互补序列；SEQIDNO:89；SEQIDNO:89的互补序列；SEQIDNO:90；SEQIDNO:90的互补序列；SEQIDNO:137；SEQIDNO:137的互补序列；SEQIDNO:138；SEQIDNO:138的互补序列；至少19个连续核苷酸的片段，其包含全部或部分的SEQIDNO:88-90,137,和138中之任一；至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，所述片段包含全部或部分的SEQIDNO:88-90,137,和138中之任一；根萤叶甲属(Diabrotica)生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:87-90,137,和138中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:87-90,137,和138中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，其包含全部或部分的SEQIDNO:88-90,137,和138中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，所述片段包含全部或部分的SEQIDNO:88-90,137,和138中之任一。2.权利要求1的核酸分子，其进一步包含至少一个包含选自下组的核苷酸序列的多核苷酸：全部或部分的SEQIDNO:1；SEQIDNO:1的全部或部分互补序列；SEQIDNO:2；SEQIDNO:2的互补序列；SEQIDNO:3；SEQIDNO:3的互补序列；SEQIDNO:1-3中之任一的至少19个连续核苷酸的片段；SEQIDNO:1-3中之任一的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列；根萤叶甲属生物体的天然编码序列，其包含SEQIDNO:1-3中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:1-3中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段，所述天然编码序列包含SEQIDNO:1-3中之任一；根萤叶甲属生物体的天然编码序列的至少19个连续核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含SEQIDNO:1-3中之任一。3.权利要求1的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组：SEQIDNO:108；SEQIDNO:108的互补序列；SEQIDNO:116；SEQIDNO:116的互补序列。4.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸为SEQIDNO:109。5.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸的长度是至少约50个核苷酸。6.权利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸的长度是至少约100个核苷酸。7.权利要求1的核酸分子，其中所述启动子是在植物细胞中功能性的，且其中所述分子是植物转化载体。8.权利要求1的核酸分子，其中所述根萤叶甲属生物体选自下组：玉蜀黍根萤叶甲(D.v.virgiferaLeConte)；北美玉蜀黍根萤叶甲(D.barberiSmithandLawrence)；D.u.howardi；D.v.zeae；D.balteataLeConte；D.u.tenella；和D.u.undecimpunctataMannerheim。9.一种核糖核酸(RNA)分子，其由权利要求1的核酸分子的多核苷酸编码。10.权利要求9的RNA分子，其中所述分子是双链核糖核酸(dsRNA)分子。11.权利要求10的dsRNA分子，其中该分子被鞘翅目有害生物摄取后抑制与所述核苷酸序列特异性互补的内源靶基因的表达。12.权利要求11的dsRNA分子，其中所述分子的摄取杀死所述鞘翅目有害生物或抑制所述鞘翅目有害生物的生长、繁殖、和/或...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·E·纳瓦，H·李，C·耿，I·拉里诺阿，M·B·奥尔森，N·埃兰戈，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国,US