高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3及其衍生物制造技术

本发明专利技术公开高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3及其衍生物。谷胱甘肽核酸适体的核苷酸序列为：gtacacttga agggtaagga ctcccgta，命名为GSH3。谷胱甘肽核酸适体制备方法包括：构建随机序列文库，筛选靶物质‑核酸复合物，分离目的寡核苷酸适体，PCR扩增目的寡核苷酸适体，循环筛选出高度特异性适体，谷胱甘肽核酸适体的修饰。制备获得的核酸适体无毒性，分子量小，易于合成与标记，只特异性识别谷胱甘肽，对其他异型半胱氨酸或其类似物不识别结合，可成为检测谷胱甘肽含量的分子信标。

【技术实现步骤摘要】
高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3及其衍生物1.
本专利技术属于氨基酸检测
，涉及一种核酸，特别是涉及高特异性和高亲和力的谷胱甘肽核酸适体及其制备方法。
技术介绍
谷胱甘肽(glutathione,r-glutamylcysteingl+glycine,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故常简写为G-SH），易与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属）等结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。目前常用的同型半胱胺酸的检测方法有三大类：色谱法、免疫学法、循环酶法。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化；而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。免疫学法需要还原游离GSH形式，抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测游离型同型半胱胺酸，只能检测血浆总同型半胱胺酸，用还原剂在37℃半小时卵育对血样进行还原处理。免疫学法需一小时以上才能出结果，操作步骤繁琐，因为需要进行还原处理可受一些不确定的因素影响。循环酶法过程繁琐，且检测限低、产生误差较大，价格昂贵，故得不到推广。核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子,国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成)文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程),并结合体外扩增技术,经过多轮的循环选择富集,获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25~60个核苷酸。由上可知，核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊断中具有良好的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道较少,但应用适体检测氨基酸的研究却不断增多,基于适体的检测新技术也不断出现。但是目前基于核酸适体的针对于谷胱甘肽的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于谷胱甘肽的核酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。2.
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的谷胱甘肽检测技术的不足，填补还未见谷胱甘肽的核酸适体及其筛选制备方法空白，提供一种谷胱甘肽核酸适体及其制备方法，本专利技术所提供的核酸适体命名GSH3。本专利技术的方案是通过这样实现的：一种高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3，所述核酸适体的核苷酸序列其序列为：gtacacttgaagggtaaggactcccgta。以上所述高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种：（1）将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；（2）权利要求1中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；（3）权利要求1中所述核酸适体改造成的肽核酸；（4）权利要求1中所述核酸适体改造成的锁核酸。一种以上所述高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3或其衍生物在识别、检测谷胱甘肽，或者制备检测谷胱甘肽的试剂盒方面的应用。为了使本专利技术公开充分，本专利技术谷胱甘肽核酸适体的制备方法步骤如下：谷胱甘肽核酸适体的制备方法包括以下步骤：1）合成单链DNA随机序列寡核苷酸库：所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，作为PCR扩增引物结合区，中间为60个碱基的随机序列，库容量1015以上。所述PCR引物为：引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’引物2：5’-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’所述PCR引物2带有5’端生物素标记。2）制备连接谷胱甘肽的固相基质：以微磁珠为基质，通过化学方法把谷胱甘肽通过其羧基共价连接到微磁珠上。3）初次筛选目的寡核苷酸序列：将DNA随机寡核苷酸库与谷胱甘肽混合，筛选除去DNA随机寡核苷酸库中不结合和非特异结合谷胱甘肽的寡核苷酸序列，回收特异结合谷胱甘肽的核酸序列。4）制备次级单链DNA寡核苷酸库：将步骤3中所得与谷胱甘肽特异结合的寡核苷酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物以链霉亲和素微磁珠为基质进行分离，经过碱变性解链，过滤，纯化，获得次级DNA寡核苷酸库，用于下一轮筛选。5）筛选并鉴定谷胱甘肽核酸适体：将步骤4所得的次级单链DNA寡核苷酸库进行下一轮筛选，经过15轮筛选后获得目标寡核酸序列。克隆并测序所述目标寡核酸序列，通过酶联核酸适体吸附测定法鉴定其与谷胱甘肽结合的特异性和亲和力。6）所述谷胱甘肽核酸适体可作为检测试剂用于检测谷胱甘肽。本专利技术的有益效果如下：（1）所筛选到的核酸适体分子量小，无毒性，有利于分子探针的设计，易于合成与标记；（2）核酸适体只特异的识别谷胱甘肽，不结合非谷胱甘肽和其它氨基酸分子，结合谷胱甘肽的能力是结合非谷胱甘肽Hb的能力的20~80倍，可以成为鉴别谷胱甘肽的试剂，提高检测方法的特异性和灵敏度，简化检测方法，降低成本。附图说明图1为本专利技术核酸适体与谷胱甘肽的结合能力，图1中横坐标为核酸适体DNA浓度，纵坐标为解离常数(Kd)相对值，图中GSH曲线表示核酸适体GSH3与谷胱甘肽的结合曲线，Cy曲线表示核酸适体GSH3与非谷胱甘肽（半胱氨酸Cy）的结合曲线。具体实施方式实施1谷胱甘肽特异结合的核酸适体GSH3的制备构建随机序列寡核苷酸库：人工合成单链DNA序列，构建库容量为1×105的单链DNA随机序列寡核苷酸库，单链DNA随机寡核苷酸库包括的DNA序列为：5’-GGATCCACCAGCGTCATCAGCA-N25~40-AGATAGTAAGTGCAATCTGGC-3’所述单链DNA随机寡核苷酸库的DNA序列包括中间随机序列N25~60和两端固定序列，所述中间随机序列N25~40为25~40个碱基的随机序列，所述两端固定序列为：5’-GGATCCACCAGCGTCATCAGCA，3’-CGGTCTAACGTGAATGATAGA，所述两端固定序列为PCR扩增引物结合区1）将0.5ml(1x109微粒)Invitrogen公司的带有活化氨基的微磁珠与1mol/L谷胱甘肽在偶联缓冲液（20mM磷酸钾盐缓冲液，0.15MNaCl,1mMDTT,pH5.5）中混合，加入200ul偶联剂溶液[57%1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)]，将上述反应置于25ºC条件下轻混24小时。将藕连谷胱甘肽的磁珠用磁珠分离装置和清洗液（PBS，1mMDTT，批H7.3）清洗后，重新悬浮于0.5mlPBS中。2）将5nmol单链DNA文库溶于结合缓冲液（100mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列其序列为：gtacacttga agggtaagga ctcccgta。

【技术特征摘要】
1.一种高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列其序列为：gtacacttgaagggtaaggactcccgta。2.一种权利要求1所述高亲和力谷胱甘肽核酸适体GSH3的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种：（1）将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖皓，
申请(专利权)人：王颖皓，
类型：发明
国别省市：广西,45