沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子及筛选方法与应用技术

本发明专利技术公开的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，通过建立稳定表达H5N1型禽流感病毒NS1‑表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的人胚肾293细胞系，合成4条靶向NS1基因不同位点的siRNA，并转染该稳定细胞系；通过实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western‑blot检测siRNA的沉默效果，最终筛选出沉默NS1基因表达效果最好的siRNA(299)。本发明专利技术为后续研究H5N1型禽流感病毒NS1基因在感染及致病中的分子机制和进一步应用核糖核酸干扰技术通过抑制H5N1型禽流感病毒NS1基因的表达奠定了重要基础，有很好的实用价值。

【技术实现步骤摘要】
沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子及筛选方法与应用
本专利技术属于生物基因工程及生物技术药物
，具体涉及一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，本专利技术还涉及一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法与应用。
技术介绍
禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种能够在禽类和人类之间相互传播的传染病，严重威胁着全球范围内的禽类养殖业，也日益威胁着人类健康。世界动物卫生组织(OIE)将AI分为3类：高致病性、低致病性和非致病性。我国将高致病性AI列为一类动物疫病，其中高致病性禽流感病毒H5N1亚型、以及2013年3月在人体上首次发现的新禽流感H7N9亚型尤为引人关注，不仅造成了人类的伤亡，同时重创了家禽养殖业。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)属于正黏科病毒，其基因组主要由单股负链RNA组成，RNA含有8大小不同的片段，NS基因位于第8个片段，在感染初期翻译形成NS1蛋白，它是目前为止发现的唯一一个非结构蛋白，主要以二聚体的形式存在于核内，分子量为24kD，它是一种多功能调节蛋白，主要作用是通过调控干扰素和肿瘤坏死因子的释放而抑制宿主蛋白的合成。NS1蛋白的功能主要包括两个方面：首先，它是AIV的主要毒力因子，对病毒的感染、复制和变异具有重要影响，它可以与宿主细胞核蛋白相互作用，阻断细胞核mRNA的运输，从而抑制宿主蛋白的生物合成；其次，它能够拮抗干扰素和肿瘤坏死因子的分泌，有报道称NS1基因敲除病毒比亲本病毒诱导宿主产生干扰素和肿瘤坏死因子的含量更高。AIV形态呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜，依据其外膜血凝素(H)/和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。感染人类的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2)，可经6～9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5N1)。核糖核酸干扰(RNAinterference，RNAi)是指由特定双链核糖核酸(doublestrandedRNA，dsRNA)引发同源信使核糖核酸(messengerRNA，mRNA)降解的转录后基因沉默机制。这类特定双链核糖核酸被裂解成小干扰核糖核酸分子(siRNAs)，并能导致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸诱导的静默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)作用下降解。核糖核酸干扰(RNAi，Ribonucleicacidinterference)RNA是目前简单而高效地阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一，可达到基因敲除效果，且安全性好。但对于核糖核酸干扰(RNAi)来说，并不是所有针对靶基因信使核糖核酸(mRNA)序列随机设计的小干扰核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。因此，对能有效抑制特异基因表达的小干扰核糖核酸分子(siRNAs)的筛选是应用核糖核酸干扰(RNAi)技术进行基因功能、基因治疗等相关研究的重要基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，能够有效沉默禽流感病毒亚型H5N1中NS1基因表达，为开展靶向H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的基因功能、基因治疗的相关研究提供了依据。本专利技术的第二个目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法。本专利技术的第三个目的是提供一种沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的应用。本专利技术所采用的技术方案是，沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，小核糖核酸分子的序列信息为：正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5′–3′)；反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5′–3′)。本专利技术所采用的第二个技术方案是，沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，包括以下步骤：步骤1，构建重组表达质粒pNS1-EGFP；步骤1.1，根据H5N1型禽流感病毒NS1基因序列，参照pEGFP-N1载体信息，设计NS1真核表达引物F、R；同时将所述pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中引物F、R进行降落PCR扩增NS1CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经XhoI和EcoRI双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，XhoI和EcoRI双酶切鉴定，得到重组表达质粒pNS1-EGFP；步骤2，稳定表达H5N1型禽流感病毒的NS1-EGFP稳定细胞系构建；步骤3，根据NS1基因的序列，合成针对NS1基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs；步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条小干扰核糖核酸分子siRNAs转染步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系；步骤5，经过步骤4的转染48h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western-blot检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的小核糖核酸分子。本专利技术的特征还在于，步骤1.1中NS1真核表达引物F、R具体为：F:5’-GCGCCTCGAGATGGATTCCAACACTGTG-3’；R:5’-CGCGGAATTCCTTTGGAGAGAGTGGAGG-3’；其中引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点。步骤1.2中降落PCR扩增NS1CDS编码区的反应体系为50μL，具体为：模板cDNA1.5μL，上、下游引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix26μL，灭菌蒸馏水20.5μL；降落PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行22个循环反应；最后，72℃后延伸10min。步骤2的具体过程为：步骤2.1，将人胚肾293细胞HEK293在含体积分数10％的胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培养基中，于温度37℃、体积分数5％的二氧化碳的饱和湿度下培养，在转染的前一天，计数人胚肾293细胞HEK293并铺于6孔板中，确保转染时细胞密度达到70-80％；步骤2.2，用250μL无血清的优化改良伊格氏完全培养基I分别稀释2μg步骤1的重组表达质粒pNS1-EGFP和6μL转染试剂，在转染当天孵育5min后，将两者轻微混匀后于室温孵育20min，得到脱氧核糖核酸-转染试剂复合物；步骤2.3，将步骤2.2的脱氧核糖核酸-转染试剂复合本文档来自技高网...

【技术保护点】
沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，其特征在于，所述小核糖核酸分子的序列信息为：正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5′–3′)；反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5′–3′)。

【技术特征摘要】
1.沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子，其特征在于，所述小核糖核酸分子的序列信息为：正义，GGGAUUGGUUAAUGCUCAUTT(5′–3′)；反义，AUGAGCAUUAACCAAUCCCTT(5′–3′)。2.如权利要求1所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建重组表达质粒pNS1-EGFP；步骤1.1，根据H5N1型禽流感病毒NS1基因序列，参照pEGFP-N1载体信息，设计NS1真核表达引物F、R；同时将所述pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中引物F、R进行降落PCR扩增NS1CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经XhoI和EcoRI双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，XhoI和EcoRI双酶切鉴定，得到重组表达质粒pNS1-EGFP；步骤2，稳定表达H5N1型禽流感病毒的NS1-EGFP稳定细胞系构建；步骤3，根据NS1基因的序列，合成针对NS1基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs；步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条小干扰核糖核酸分子siRNAs转染步骤2的NS1-EGFP稳定细胞系；步骤5，经过步骤4的转染48h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应、流式细胞术以及Western-blot检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默H5N1型禽流感病毒NS1基因表达的小核糖核酸分子。3.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.1中NS1真核表达引物F、R具体为：F:5’-GCGCCTCGAGATGGATTCCAACACTGTG-3’；R:5’-CGCGGAATTCCTTTGGAGAGAGTGGAGG-3’；其中引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的XhoI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点。4.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.2中降落PCR扩增NS1CDS编码区的反应体系为50μL，具体为：模板cDNA1.5μL，上、下游引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix26μL，灭菌蒸馏水20.5μL；所述降落PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸2min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到44℃，再按照94℃预变性3min；94℃变性30s，44℃退火30s；72℃延伸2min进行22个循环反应；最后，72℃后延伸10min。5.根据权利要求2所述的沉默NS1基因表达的小核糖核酸分子的筛选方法，其特征在于，所述步骤2的具体过程为：步骤2.1，将人胚肾293细胞HEK293在...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦寒伟，黄庆洲，伍莉，陈吉轩，帅学宏，甘玲，王红均，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50