与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记及其获得方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术工程和番茄雄性不育遗传育种技术领域，具体公开一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记及其获得方法和应用，SNP位点是在简化基因组测序基础上，通过关联分析而获得；SNP223标记是利用含有SNP位点的多态性DNA片段，通过设计特异性引物而获得。实验证明，与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP标记可用于番茄雄性不育系的辅助选择育种，与第二代分子标记相比，检测方式更为准确，检测效率也更高。

【技术实现步骤摘要】
与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记及其获得方法和应用
本专利技术属于生物遗传育种
，具体公开一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记及其获得方法和应用。
技术介绍
杂种优势是生物界的普遍现象，是改良作物、大幅度提高产量的重要途径。从20世纪初开始，在各种作物中已先后发现了雄性不育现象，并且在生产上利用雄性不育生产杂交种。在一些作物中，如玉米、高粱、水稻等作物上已经取得了较大成就。番茄是自花授粉作物，杂种优势十分明显，杂交种比普通品种增产20％-30％以上，而且整齐度高，抗逆性强。随着番茄高产、优质、抗逆等多目标育种难度的增加，利用杂种互补效应实现番茄产量、品质、抗性等性状的同步突破，已成为番茄育种研究的一个重要发展方向。由于目前番茄雄性不育系利用上尚存在一定困难，生产上大面积推广的杂交种，仍然以人工去雄为主，制种成本过高已成为番茄杂种优势利用的主要限制因素之一。因此，杂种番茄的大规模推广利用仍有待于高效率、低投入的制种方法突破。由于生物的遗传多样性，研究人员一直在不懈努力寻找个体及群落之间的差异，从而为能更好的解读遗传的复杂过程和本质。遗传标记(Geneticmarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离且易于识别的可遗传的等位基因变异。遗传标记的发展从形态学、细胞学、生物化学到目前研究中常用的DNA分子标记，历经了从表型到微观分子水平的发展过程。SNP(SingleNucleotidePolymorphism)，即为单核苷酸多态性，是继RFLP、SSR之后新的分子标记技术。通常呈双等位基因多态性，一般有2个等位基因和3种基因型，又称为双等位基因标记(biallelicmarker)。并根据多态性，可绘制出插入或缺失的遗传图谱，同时也可通过分析PCR产物大小，来有效鉴别各个体的基因型。目前，在番茄中已经开发出来的分子标记已经超过2300个，为构建高密度的分子遗传图谱提供了重要保障。但由于分子标记技术使用成本较高、不易操作、很难获得有效地分子标记，虽然分子标记辅助选择被认为是作物改良中表型选择最有效的替代手段，在寻找与性状连锁的分子标记方面也投入了巨大的资金，但是至今为止分子标记辅助选择还没有被作为一个常规程序应用到大多数番茄育种项目中。因此，在进行番茄分子标记开发的时候，要力争获得信息量大、操作简单和使用成本低的分子标记。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的实际问题，本申请提供并揭示了一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP位点及分子标记，并提供了一种操作简单，成本低廉的获取该特异性DNA片段的方法，从而深刻的打开了该分子标记开发利用的应用场景和想象空间，为基于图谱克隆基因的实际应用奠定了基础。技术方案：一、一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记，其具有SEQIDNO.3所示的序列。进一步，确定SNP223位点，SEQIDNO.3所示的序列中第144位SNP位点n＝a或t，定义为SNP223，基因型为A/A纯合、T/T纯合或A/T杂合，其中当n＝a时，该分子标记为不育的特异性DNA片段；当n＝t时，该分子标记为可育的特异性DNA片段。二、用于扩增所述SNP分子标记的特异性引物对，包括其具有上游引物序列如SEQIDNO.1和下游引物序列SEQIDNO.2所示。利用在线软件Primer3在该SNP223位点的两端设计特异性扩增引物：上游引物：5’-GGTGATGGCGTCAGTGATTA-3’；下游引物5’-AATGGAATTCCCCAGTACCC-3’，所述分子标记的扩增产物为335bp。三、一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记的获取方法，以雄性不育系BY-17为母本(原编号为2-031，从番茄遗传中心引进，这是个开放的机构，一般普通研究人员均可申请引进材料)，以雄性可育系KY-113为父本(原编号为LA0012，也是从番茄遗传中心引进)，构建30×30F2群体的DNA池；通过简化基因组测序，检测不育亲本、可育亲本、不育池和可育池基因组间特定位置的特异性DNA片段，筛选存在SNP位点多态性的特异性DNA片段；通过关联分析，获得与番茄雄性不育基因相关联的SNP223位点；利用SNP223位点所在的特异性DNA片段，设计SNP分子标记的特异性引物对，获得与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP223分子标记。四、一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记的应用，该SNP分子标记可应用于番茄雄性不育品系的辅助选择育种。五、一种检测与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP223位点的试剂盒，含有上述特异性引物对。上述试剂盒采用PCR方法进行检测，其20μL反应体系为：进一步，所述试剂盒采用PCR方法进行检测，其20μL反应体系最佳方案为：上述试剂盒中PCR扩增工作程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。进一步，试剂盒中所述最佳退火温度为55℃。本专利技术的积极性效果及应用如下：1、本专利技术使用的PCR扩增及测序体系，不需要特殊的PCR和测序仪器，普通的实验室均能达到要求；2、本专利技术获得与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP位点及标记，是在对番茄雄性不育种质BY-17、可育种质KY-113及其F2遗传群体分析而获得的新标记，该标记与雄性不育基因紧密连锁，PCR扩增重复性好，稳定性强，可以用于番茄雄性不育品种鉴定和番茄雄性不育后代的分子辅助选择，进而加快雄性不育品种的育种进程；3、为克隆番茄雄性不育基因、基因序列分析以及转雄性不育基因的番茄研究奠定了良好的基础。附图说明附图1显示在番茄第2条染色体上多态性SNP位点(定义为SNP223)在不育亲本、可育亲本、不育基因池及可育基因池间SNP拟合值分布图，其中，图中曲线(2)表示最大拟合值，图中直线(1)表示最大拟合值99％的阈值线，图中曲线(4)表示SNP拟合值，图中直线(3)表示SNP拟合值99％的阈值线；筛选拟合值同时在两个阈值以上的标记位点为多态性标记位点；附图2显示SNP223特异引物的扩增序列及突变位点；“wild”为可育的扩增序列；“mutant”为不育的扩增序列。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP位点获得及标记开发的方法，包括以下步骤：(1)以番茄雄性不育系BY-17为母本(原编号为2-031，从番茄遗传中心引进，这是个开放的机构，一般普通研究人员均可申请引进材料)，以雄性可育系KY-113为父本(原编号为LA0012，也是从番茄遗传中心引进)，构建F2遗传群体；(2)待到番茄开花期分别提取30株F2代雄性不育单株和30株F2代雄性可育单株的基因组DNA，建成雄性不育基因池和雄性可育基因池，同时提取父母本的基因组DNA，建立父母本基因池；(3)利用酶切位点预测软件对参考基因组进行系统分析，主要根据基因组大小、GC含量、重复序列比例和基因结构特点等信息，设计候选酶切方案，保证分子标记在全基因组范围内开发的密度及均匀性。本专利技术采取RsaI限制性内切酶，酶切片段的长度范围为414-464bp。将处理好的样品进行精确定量，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记，其具有SEQ ID NO.3所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记，其具有SEQIDNO.3所示的序列。2.根据权利要求1所述的一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于：所述SEQIDNO.3所示的序列中第144位SNP位点n＝a或t，定义为SNP223，基因型为A/A纯合、T/T纯合或A/T杂合，其中当n＝a时，该分子标记为不育的特异性DNA片段；当n＝t时，该分子标记为可育的特异性DNA片段。3.用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的特异性引物对，包括其具有上游引物序列如SEQIDNO.1和下游引物序列SEQIDNO.2所示。4.一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记的获取方法，以雄性不育系BY-17为母本，以雄性可育系KY-113为父本，构建30×30F2群体的DNA池；通过简化基因组测序，检测不育亲本、可育亲本、不育池和可育池基因组间特定位置的特异性DNA片段，筛选存在SNP位点多态性的特异性DNA片段；通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：王柏柯，李宁，王娟，唐亚萍，杨涛，王强，帕提古丽·艾斯木托拉，杨生保，余庆辉，
申请(专利权)人：新疆农业科学院园艺作物研究所，
类型：发明
国别省市：新疆,65