本发明专利技术提供了一种简并引物以及利用该引物大规模克隆植物中抗农业病虫害蛋白基因的方法，其方法是根据蛋白的保守性设计了一对通用简并引物，利于这对简并引物可快速地对各种单子叶植物中存在的具有抗农业病虫害生物活性的甘露糖结合蛋白进行基因克隆，可快速获得大量甘露糖结合蛋白新基因，极大地丰富了这类抗农业病虫害植物蛋白质基因的数量，为抗病虫害转基因农业的研究和生产提供了候选基因储备。
【技术实现步骤摘要】
简并引物及利用该引物克隆植物中抗病虫害蛋白基因的方法
本专利技术属于抗农业病虫害植物分子领域，特别涉及利用通用简并引物大规模克隆植物中抗农业病虫害蛋白基因。
技术介绍
通过对兰科、百合科、天南星科和石蒜科植物海芋、风雨花、朱顶兰、玉莲、黄花石蒜、大蒜、葱、脉羊耳兰、黄精等的研究表明，在其植物体内，含有丰富的能特异结合甘露糖的蛋白质，并且，这些能特异结合甘露糖的蛋白质对农作物害虫及病害具有显著的抑制效果。这为转基因作物抗农业病虫害的研究和生产提供了新的候选基因资源。面对一个具有抗农业病虫害活性的巨大的候选基因资源群体，通常，多是通过设计特异性的引物，克隆其中的一个基因，经基因工程的方式应用到转基因农作物中。而找到植物中甘露糖结合蛋白家族基因的简并引物，能有效地大规模克隆此类目的基因，并且对研究未被报道的该蛋白家族基因提供有力的引导。目前，还未出现与之相关的简并引物设计及序列的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一对植物中具有抗农业病虫害的甘露糖结合蛋白质的基因家族的简并引物，用以大规模克隆该类基因家族成员，为抗农业病虫害转基因农业研究和生产提供丰富的候选基因资源。本专利技术所述的简并引物设计，是利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，以“mannose-bindinglectin”为检索词，进行“Nucleotide”检索，得到植物中甘露糖结合蛋白质的基因的所有记录条目，进入“ZephyranthescandidalectinmRNA,completecds”条目，接着进入其指向的蛋白记录页面(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/20531731)。在上述的蛋白记录页面，进行“RunBlast”，将所有100条已记录的氨基酸序列进行多序列比对，从而发现这些植物中甘露糖结合蛋白序列中的保守氨基酸序列，比对结果见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi。选择这些蛋白质中的一条氨基酸序列，至引物设计软件PrimerPremier5中，先将其翻译为核苷酸序列，由于密码子的简并性，得到一条具有简并性的核苷酸链，据此，将比对结果中的植物甘露糖结合蛋白的保守区域包含在这条简并性核苷酸序列之内，设计合适的简并引物对。这对简并引物的序列是：上游引物：5’-AYGGNCCNTAYACNTTYATHATGC-3’；下游引物：5’-RTNAGTNCCNGTNGCCCAYT-3’。简并引物中：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝G/C，W＝A/T，H＝A/T/C，B＝G/T/C，V＝G/A/C，N＝A/T/G/C。我们还提供了一种大规模克隆植物中抗农业病虫害蛋白基因的方法，该方法包括以下步骤：利用上述一对简并引物对单子叶植物甘露糖结合蛋白基因的保守序列进行PCR反应，然后以此PCR产物为反应模板，利用3’，5’RACE的方法，对该单子叶植物甘露糖结合蛋白基因序列进行PCR反应，最终克隆到目的基因。所述单子叶植物包括但不局限于兰科(Orchidaceae)、百合科(Liliaceae)、天南星科(Araceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)植物。进一步的，所述农业病虫害包括：刺吸式口器害虫中的棉蚜、麦蚜、桃蚜蚜虫、褐飞虱、叶蝉及鳞翅目害虫；以及水稻稻瘟病、纹枯病、小麦赤霉病。本专利技术提供了植物中具有抗农业病虫害生物活性的甘露糖结合蛋白的基因的简并引物，可用于大规模克隆该家族中基因，为其更广泛应用于抗农业病虫害转基因农业的研究实践提供基础，并且对还未被发现的该家族蛋白成员的研究提供支持。具体实施方式实施例一：玉帘(Zephyranthescandida(Lindl.))和一叶兰(AspidistraelatiorBlume)植物中甘露糖结合蛋白的基因克隆实施例1：玉帘、一叶兰中总RNA提取、质量检测及反转录1.材料与方法1.1材料1.1.1植物材料：玉帘和一叶兰植物分别采集自中国四川峨眉山及屏山，冷冻保存于-80℃备用。1.1.2酶及试剂盒：RNA提取试剂盒购自TaKaRa宝生物工程有限公司(中国大连)、MLV反转录酶、TdT(核苷酸末端转移酶)、RNaseInhibitor1.2方法1.2.1玉帘、一叶兰的总RNA提取将两种植物材料分别在液氮下迅速研磨，使用RNA提取试剂盒(TaKaRa宝生物工程有限公司)，依据试剂盒说明书，提取其总RNA，再在微量离心管中配制如下反应液去除总RNA中的DNA：将上述微量离心管中的反应液与37℃反应20-30min，加入50μlDEPC-H2O，加入100μl的苯酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)，离心，取上层移至另一微量离心管中，加入10μl3M的醋酸钠溶液(pH＝5.2)，再加入250μl无水乙醇，于-20℃放置30-60min，离心回收沉淀，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥得到样品RNA。1.2.2紫外分光光度法检测总RNA质量用蒸馏水对待测RNA样品做一定倍数稀释至稀释体积可用于测OD值，另取蒸馏水为空白对照，分别在波长为260nm、280nm、310nm处测定RNA样品OD值，根据公式ssRNA＝40×(OD260-OD310)×稀释倍数。计算RNA浓度，根据OD260/OD280判断所提取RNA的纯度，OD260/OD280约2.0质量较好，进而确定是否需要重新提取RNA。1.2.3总RNA反转录合成cDNA步骤(1)：向0.5ml的离心管中加入如下成分：通用引物15-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT-3’。：步骤(2)：将步骤(1)所述混合物置于70℃10min，使得RNA变性；置于冰上2min；离心5秒后收集混合物至管底，并加入如下成分：加入上述成分后，步骤(1)(2)总体积为24μl。步骤(3)：轻轻振荡，混匀，离心5秒，收集化合物至管底，置42℃孵育1min；步骤(4)：加入1μlMLV(反转录酶)，42℃水浴孵育1-2小时；步骤(5)：70℃放置15min从而终止反应；步骤(6)：离心5秒，收集反应物cDNA置于冰上，可存储在-20℃备用。实施例2：3’RACEPCR反应2.材料与方法2.1材料2.1.1简并引物使用本专利技术中所述的简并引物，其序列如下：上游引物：5-AYGGNCCNTAYACNTTYATHATGC-3’；；下游引物：5-RTNAGTNCCNGTNGCCCAYT-3’。2.1.2酶及试剂盒TaqDNA聚合酶、3’RACE试剂盒购自TaKaRa宝生物工程有限公司(中国大连)、柱式胶回收试剂盒购自Omiga公司2.2方法2.2.1第一轮PCR扩增反应按以下方案配制PCR扩增反应液：PCR反应条件：将cDNA产物置于98℃，2min热变性，再(94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1min；共计30个循环)，再置于72℃反应10min，4℃保存。反应在GeneAmpPCRSystem2400热循环仪(Promega公司，北京)上进行。2.2.2第二轮PCR扩增反应第二次PCR反应以本实施例1.2.1中所述的第一轮PCR反应产物为模板，将第一轮PCR反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种简并引物，其特征在于：上游引物：5’‑ AYGGNCCNTAYACNTTYATHATGC‑3’；下游引物： 5’‑ RTNAGTNCCNGTNGCCCAYT‑3’；所述简并引物中：R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=G/C，W=A/T，H=A/T/C，B=G/T/C，V=G/A/C，N=A/T/G/C。
【技术特征摘要】
1.一种简并引物，其特征在于：上游引物：5’-AYGGNCCNTAYACNTTYATHATGC-3’；下游引物：5’-RTNAGTNCCNGTNGCCCAYT-3’；所述简并引物中：R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=G/C，W=A/T，H=A/T/C，B=G/T/C，V=G/A/C，N=A/T/G/C。2.一种大规模克隆植物中抗农业病虫害蛋白基因的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：利用权利要求1所述的一对简并引物对单子叶植物甘露糖结合蛋白基因的保守序列进行PCR反应，然后以此PCR产物为反应模板，利用...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍锦库，吴传芳，梁丹凤，龙鑫，袁媛，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51
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