用于扩增HIV‑1B亚型病毒env基因的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于扩增HIV‑1 B亚型病毒env基因的引物，包括上游引物env‑H3和下游引物env‑B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。本发明专利技术的引物可能够明确地扩增出带有Hind III、BamH I双酶切位点的HIV‑1 B亚型病毒env基因片段，且能够用于包装假病毒。据此，还可进一步组装成方便使用的PCR扩增试剂盒，以及建立相应的PCR扩增方法。应用本发明专利技术仅涉及巢式PCR、琼脂糖凝胶电泳等常用方法，操作简便，易于掌握。因此，本发明专利技术对HIV‑1 B亚型病毒的研究具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】
用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的引物及其应用
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的引物及其应用。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)可以分为两型：HIV-1与HIV-2。HIV-1具有较高的毒力，更容易传播并引起获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS)，对全球的公共卫生来说是一个巨大的威胁。根据世界卫生组织(WHO)显示，截至2016年底，全球大约有3670万人感染了艾滋病毒，其中有1950万人接受了抗病毒治疗。随着高效抗逆转录病毒治疗的广泛应用，极大地减少了AIDS患者的死亡率并提高了生活质量；但也不可避免地导致HIV-1病毒发生突变，使耐药菌株感染的病例不断出现。目前我国已报道确定的流行毒株有A、B、B’、C、D、F6种亚型和3种重组毒株：A/E和2种不同的B/C。B亚型是欧美流行的优势毒株，在20世纪80年代传入我国云南静脉吸毒人群，随着时间的推移发生变异，并在我国广泛流行开来，在HIV-1感染者中占据一定的比例。HIV-1病毒的env结构基因编码包膜糖蛋白具有高度的变异性，对于检测HIV-1病毒的耐药性具有重大的意义。目前主要采用巢式PCR对env基因进行扩增，在扩增env基因片段的过程中，可能被重组，小片段env序列的改变将影响膜蛋白的生物学功能。在已有的制备假病毒方法中，存在env区基因克隆耗时、过程繁琐、价格昂贵的缺点，使用已有序列进行合成并不一定能够做出可用于包装假病毒的克隆。针对能特异扩增env基因并解决env基因克隆缺点的研究非常有意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的引物及其应用，该引物具有特异性高的特点，能准确高效地扩增获得env基因片段用于包装假病毒。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的引物，包括上游引物env-H3和下游引物env-B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。上述引物用于制备扩增HIV-1B亚型病毒env基因的试剂盒。用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的试剂盒，含有上游引物env-H3和下游引物env-B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。上述用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的试剂盒，含有以下试剂：MaxDNAPolymerase(2×)、ForwardPrimer、ReversePrimer、RNaseFreeddH2O，ForwardPrimer、ReversePrimer包括两对引物，分别是用于第一轮RT-PCR的上游引物env-1F和下游引物env-1R，以及用于第二轮PCR的上游引物env-H3和下游引物env-B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。针对现有env基因扩增及包装假病毒的问题，专利技术人设计并合作了用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的引物，包括上游引物env-H3和下游引物env-B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。本专利技术的引物可能够明确地扩增出带有HindIII、BamHI双酶切位点的HIV-1B亚型病毒env基因片段，且能够用于包装假病毒。据此，还可进一步组装成方便使用的PCR扩增试剂盒，以及建立相应的PCR扩增方法。应用本专利技术仅涉及巢式PCR、琼脂糖凝胶电泳等常用方法，操作简便，易于掌握。因此，本专利技术对HIV-1B亚型病毒的研究具有重大价值。附图说明图1是未加入HindIII酶切位点及kozak序列的引物序列的基本信息，即inhouse法的上游引物序列的基本信息。图2是未加入BamHⅠ酶切位点及kozak序列的引物序列的基本信息，即inhouse法的下游引物序列的基本信息。图3是HIV-1env基因扩增电泳图，图中：1-24为24个不同样本的PCR产物，MARK为DL5000DNAMARK。图4是pcDNA3.1-env重组质粒鉴定电泳图，图中：8-1～8-5为8号样本的克隆产物，MARK为DL5000DNAMARK。图5是Westernblot检测env基因重组质粒表达包膜蛋白，图中：1-4为阳性克隆转染组，5为骨架质粒单转染组。图6是pcDNA3.1-env与重组骨架质粒共转染组上清感染TZM-b1细胞荧光表达情况。具体实施方式以下通过实施例结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。一、试验材料人血浆：从HIV-1B亚型慢性感染者外周血中分离。引物合成：上海吉凯基因化学技术有限公司合成。RNA提取试剂盒：瑞士Roche公司(RocheHighPureViralRNAKit)，CatNo：11858882001逆转录试剂盒：大连宝生物工程有限公司(PrimeScriptTMRTMasterMix)CatNo：RR036A质粒：pcDNATM3.1(+)购自Invitrogen公司；重组骨架质粒pNL4-3.EGFP.E-R-由专利技术人自行构建。二、引物的设计与合成(1)引物的设计：在中国疾病预防控制中心使用的inhouse法的引物序列基础上增加酶切位点及kozak序列进行设计。上游引物env-H3(含Hind3酶切位点)的序列为：5’---CCCAAGCTTGCCACCATGAGAGTGATGGAGATCAGG---3’：下游引物env-B3(含BamH1酶切位点)的序列为：5’---CGGGATCCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAG---3’。(2)由上海吉凯基因化学技术有限公司按照设计好的引物序列合成引物。三、HIV-1cDNA的获得(1)按照RocheHighPureViralRNAKit试剂盒说明书进行人血浆病毒RNA的提取。(2)采用TakaraPrimeScriptTMRTMasterMix逆转录试剂盒，对提取出的人血浆病毒RNA进行逆转录，合成cDNA模板。逆转录反应体系为20μl：4μlPrimeScriptTMRTMasterMix(5X)、6μlRNA模板，RNaseFreeddH2O补足20μl。逆转录反应条件：37℃15min，85℃5s，一个循环，4℃保温。四、env全长基因片段的获得(1)采用巢式PCR的方法扩增HIV-1B亚型病毒env基因，所用扩增引物如表1所示：表1env基因扩增引物(2)两轮PCR反应体系均为50μl：25μlMaxDNAPolymerase(2×)、1.5μlForwardPrimer(20uM)、1.5μlReversePrimer(20uM)、5μlDNA模板，RNaseFreeddH2O补足50μl。两轮PCR反应程序均为：98℃10s；55℃5s，72℃2min30s，35cycles；72℃10min，4℃保温。(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，部分验证结果如图3所示，在指示带3000bp附近为扩增阳性样本，图中显示24份样本中有7份阳性扩增样本，其中，17、20、23号样本条带单一且清晰，可直接本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于扩增HIV‑1 B亚型病毒env基因的引物，其特征在于包括上游引物env‑H3和下游引物env‑B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的引物，其特征在于包括上游引物env-H3和下游引物env-B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。2.权利要求1所述的引物用于制备扩增HIV-1B亚型病毒env基因的试剂盒。3.用于扩增HIV-1B亚型病毒env基因的试剂盒，其特征在于含有上游引物env-H3和下游引物env-B3，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。4.根据权利要求3所述的用于扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄颉刚，梁浩，叶力，王洪，梁冰玉，蒋俊俊，黄春湲，宁传艺，臧宁，廖艳研，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45