一种D‑N‑氨甲酰水解酶及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种D‑N‑氨甲酰水解酶及应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术的D‑N‑氨甲酰水解来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)JNU503，可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D‑色氨酸，其可溶性好，催化效率高(转化率99.9％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好，具有很好的应用开发前景。

【技术实现步骤摘要】
一种D-N-氨甲酰水解酶及应用
本专利技术涉及一种D-N-氨甲酰水解酶及应用，属于生物工程

技术介绍
D-色氨酸(D-Trp)作为一种重要的手性化合物，常被用来合成一些医药中间体，还可以用作非营养型甜味剂，在食品行业倍受欢迎。D-N-氨甲酰水解酶是属于腈水解酶超家族的第6类，它可以将D-N-氨甲酰氨基酸水解得到的D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯的D-氨基酸。1998年Yamamoto等人，利用D-N-酰胺酶选择性地水解D-色氨酰胺之后通过化学水解得到D-Trp(Yamamotoetal.MethodforproducingD-tryptophan,1998,Europeanpatent,EP0853128A1)。类似于酰胺酶方法，1957年Greenstein，等人利用L-氨基酰化酶制备D-Trp，其中只有N-乙酰基-DL-色氨酰胺中的L-对映异构体被水解，剩余的对映异构体可通过化学法脱乙酰化形成D-Trp(Greenstein,J.P.,MethodsInEnzymology,1957,3:554–570)。1995年，YamamotoH等人报道可以D-色氨酸酶从DL-Trp外消旋体中降解L-Trp产生D-Trp，但是该反应的副产物丙酮酸和吲哚可抑制色氨酸酶的活性，因而需要去除(Kawasakietal.BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,1995,59:1938–1943)。目前报道的这些方法都存在理论产率为50％，过程复杂，产率低和对映选择性等缺点。尽管在1949年，EadieG等人报道可以由D-氨基酸转氨酶使得底物吲哚丙酮酸和D-丙氨酸反应的方法来制备光学纯D-Trp，该方法理论产率为100％，但是活性低，而最终的产率仅为13％(EadieGetal.JournalofBiologicalChemistry,1949,181:449–458)。海因酶过程是一个由海因消旋酶，海因酶和氨甲酰水解酶组成的三酶级联反应，由于其可以打破传统的50％转化率的限制，而且拥有较高的得率，一直以来被认为是高效经济制备光学纯D-氨基酸的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对已经报道的氨甲酰水解酶的可溶性差以及对底物D-N-氨甲酰色氨酸的低催化活性等问题，提供一种新的氨甲酰水解酶，其具有良好的可溶性，对D构型的氨甲酰氨基酸底物表现出高立体选择性，并对D-N-氨甲酰色氨酸具有高的催化活性。本专利技术的第一个目的是提供一种氨甲酰水解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供编码所述氨甲酰水解酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因含有SEQIDNO.2所示的序列。本专利技术的第三个目的是提供携带编码所述氨甲酰水解酶基因的载体。本专利技术的第四个目的是提供表达所述氨甲酰水解酶的细胞系。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞是表达氨甲酰水解酶的重组大肠杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以BL21(DE3)为宿主，以pET28a为载体，表达SEQIDNO.1所示基因。本专利技术的第五个目的是提供制备所述细胞系的方法，包括如下步骤：1)采用化学合成或PCR方法克隆编码所述氨甲酰水解酶的基因AshyuC；2)将步骤1)获得的AshyuC基因与质粒pET28a同时用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI双酶切，然后使用T4DNA连接酶进行连接，获得重组表达载体pET28a-AshyuC；3)将步骤2)获得重组表达载体pET28a-AshyuC转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-AshyuC。本专利技术的第六个目的是提供一种氨甲酰水解酶的制备方法，所述方法是培养所述细胞系，获得重组的氨甲酰水解酶。在本专利技术的一种实施方式中，培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞的类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生D-氨甲酰水解酶即可。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述细胞系在LB培养基中培养。在本专利技术的一种实施方式中，LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将表达本专利技术的氨甲酰水解酶基因的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养至OD600达0.5～0.7，在终浓度为0.1～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，28～30℃诱导培养4～8h后，即可高效表达本专利技术的重组D-氨甲酰水解酶。离心收集菌体并细胞破碎获得粗酶液，再用镍柱进行纯化，获得重组D-N-氨甲酰水解酶。本专利技术的第七个目的是提供以重组氨甲酰水解酶作为催化剂在海因酶过程级联反应中催化L-吲哚甲基海因生成D-色氨酸的方法。在本专利技术的一种实施方式中，氨甲酰水解酶的用量为1:12～2:5kU/mmol底物。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法按下述步骤进行：L-吲哚甲基海因的浓度为5～300mmol/L；所述的氨甲酰水解酶的用量为1～50kU/L；海因消旋酶的用量为1～50kU/L；D-海因酶的用量为1～25kU/L；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH6～8；所述的反应的温度为20～40℃；所述的级联反应时间以反应完全为准，一般为0.5～48小时。本专利技术还提供所述酶在制备含有D-色氨酸的产品中的应用。有益效果：本专利技术提供了一种D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-色氨酸，其可溶性好，催化效率高(转化率99.9％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好。本专利技术的氨甲酰水解酶催化效果佳，底物适用性广，具有很好的应用开发前景。附图说明图1为基因AshyuC的PCR扩增电泳图谱。M，Marker；1，基因AshyuC图2为pET28a-AshyuC重组质粒物理图谱。图3为重组D-N-氨甲酰水解酶的蛋白电泳图。M，Marker；泳道1、2、3分别为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-AshyuC诱导后上清、沉淀及纯化后的纯酶。图4为D-N-氨甲酰水解酶的选择性分析液相检测图具体实施方式D-氨甲酰水解酶的酶活力测定：D-N-氨甲酰水解酶对底物DL-N-氨甲酰色氨酸的酶活力测定体系为：适量酶液、10mmol·L-1DL-N-氨甲酰色氨酸，于30℃静置反应30min。反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为DiamonsilPlusC18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(25：75)，流速为0.2～1mL·min-1,检测波长为210nm。酶活力单位定义(U)：在30℃下，催化生成1μmol的D-色氨酸所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。实施例1D-氨甲酰水解酶基因的克隆采用一步克隆法克隆上述节杆菌中的D-N-氨甲酰水解酶基因。(1)首先使用LB培养基，于37℃下过夜培养上述节杆菌。离心获得菌体后，使用常规细菌基因组提取试剂盒获得基因组总DNA。(2)根据已报道的D-N-氨甲酰水解酶基因设计简并引物(上游引物：CGCGGATT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氨甲酰水解酶，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种氨甲酰水解酶，其特征在于，含有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列。2.编码权利要求1所述氨甲酰水解酶的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，含有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。4.携带权利要求2或3所述基因的载体。5.表达权利要求1所述氨甲酰水解酶的细胞系。6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以BL21(DE3)为宿主，以pET系列任一质粒为载体，表达权利要求1所述的氨甲酰水解酶。7.一种制备氨甲酰水解酶的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，刘亚菲，许国超，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32