一种热稳定性提高的纳豆激酶制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的纳豆激酶，属于蛋白质工程。本发明专利技术得到的纳豆激酶Q59E‑N218D和N218D，热稳定性相较于原酶有了大幅度提高。本发明专利技术提供的纳豆激酶Q59E‑N218D和N218D将在一定程度上更好的应对工艺中高温加热环节，并可以延长在机体内的作用时间，提高了纳豆激酶作为治疗心脑血管疾病口服药物的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的纳豆激酶
本专利技术涉及一种热稳定性提高的纳豆激酶，属于蛋白质工程领域。
技术介绍
纳豆激酶(NK,EC3.4.21.62)，是日本传统食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillusnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，相较于市售溶栓药物，具有高效溶血栓作用，是最具潜力的纤溶蛋白酶。而对纳豆激酶热稳定性的研究鲜有报道。纳豆激酶热稳定性较差，纯酶液于55℃处理，半衰期仅为12min左右，严重限制其在工业生产中的应用。为了促进纳豆激酶作为溶栓剂的开发与应用，急需一种能保证其在工艺生产高温环节中酶活不丧失，并延长其在机体内的作用时间的纳豆激酶。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种稳定性提高的纳豆激酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的一个或两个氨基酸位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位、第218位的一个或两个氨基酸位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第218位的天冬酰胺进行突变为天冬氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位的谷氨酰胺进行突变为谷氨酸，同时将第第218位的天冬酰胺进行突变为天冬氨酸。本专利技术的第二个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌的构建方法为：将纳豆激酶突变体的基因连接在载体pET24a上，以大肠杆菌BL21位宿主，构建重组菌。本专利技术的第三个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的方法，具体步骤如下：(1)将重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基，35-38℃、150-250r/min振荡过夜培养得到种子液。(2)将种子液按质量分数为1-2％的接种量分别接种于含卡那霉素浓度的表达培养基中，35-38℃、150-250r/min振荡培养至OD600至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG，于15-18℃诱导18-24h纳豆激酶突变体的表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述卡那霉素的浓度为80-120μg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导剂IPTG至0.05-0.2mM。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导剂IPTG至0.1mM。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达培养基为TB培养基，所述TB培养基组分为：胰蛋白胨10-14g/L,酵母提取物20-26g/L，甘油3-8g/L，KH2PO42.0-2.6g/L，K2HPO4·3H2O15.8-16.8g/L，CaCl20.15-0.25g/L，余量为水。在本专利技术的一种实施方式中，所述纳豆激酶的纯化过程：将重组菌体破碎后，收集上清，上清膜过滤后，在2-6℃下，用镍柱离心柱分离得到纳豆激酶突变体纯酶液。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的纳豆激酶突变体Q59E-N218D和N218D的热稳定性大幅度提高，Q59E-N218D在55℃下的半衰期由野生酶的11.9min延长至32.38min，N218D55℃下的半衰期由野生酶的11.9min延长至28min。因此，本专利技术提供的突变体能更好的应对工艺中高温加热环节，并可以延长在机体内的作用时间，提高了纳豆激酶的应用价值。附图说明图1野生酶(WT)和单突变体(Q59E，N218D)，双突变体(Q59E-N218D)的热稳定性曲线。于55℃下孵育，适时取样，分别测定其残留酶活。。具体实施方式LB培养基组分为：蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L、NaCl8-12g/LTB培养基组分为：胰蛋白胨10-14g/L,酵母提取物20-26g/L，甘油3-8g/L，KH2PO42.0-2.6g/L，K2HPO4·3H2O15.8-16.8g/L，CaCl20.15-0.25g/L酶活的定义：在25℃，pH8.0,底物浓度为0.4mM，1min内，将1μmolAAPF转化成1μmolpNA所需的酶量定义为一个酶活力单位。酶活测定方法：在100mMpH8.0Tris-HCl缓冲液(含0.1mMCaCl2)，以人工合成的suc-AAPF-pNA为底物，在25℃下反应3min,根据405nm的吸收值测定生成对硝基苯胺(pNA)浓度测定酶活。热稳定性确定：将野生酶和Q59E-N218D保存于55℃金属浴中，适时取样，测定其的残留酶活。实施例1纳豆激酶单突变体的构建(1)突变体Q59E的构建以pET24a-pro-NK为模版，以表1所示引物在表4所示条件下，PCR得到携带编码Q59E突变体基因的重组载体，质粒命名为pET24a-pro-NK/Q59E。表1突变体Q59E引物PCR产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定；再将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，最后用QuichCutTmDpnI于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒，转入BL21大肠杆菌宿主，重组菌命名为BL21/pET24a-pro-NK/Q59E。(2)突变体N218D的构建以pET24a-pro-NK为模版，以表2所示引物在表4所示条件下，PCR得到携带编码N218D突变体基因的重组载体，质粒为pET24a-pro-NK/N218D。表2突变体N218D引物PCR产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定；再将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，最后用QuichCutTmDpnI于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒，转入BL21大肠杆菌宿主，重组菌命名为BL21/pET24a-pro-NK/N218D。实施例2纳豆激酶双突变体的构建使用质粒小量提取试剂盒按照说明书上步骤提取pET24a-pro-NK/Q59E质粒，再以pET24a-pro-NK/Q59E为模板，以表3所示引物在表4所示条件下，PCR得到携带编码Q59E-N218D双突变体基因的重组载体。表3突变体Q59E-N218D引物表4全质粒PCR扩增反应体系PCR扩增反应条件为：PCR产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定；再将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，最后用QuichCutTmDpnI于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒，转入BL21大肠杆菌宿主，重组菌命名为BL21/pET24a-pro-NK/Q59E-N218D。实施例3纳豆激酶单突变体和双突变体的表达(1)将重组大肠杆菌BL21/pET24a-pro-NK/Q59E-N218D、BL21/pET24a-pro-NK/Q59E、BL21/pET24a-pro-NK/N218D，分别接种于5mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养得到种子液。(2)将种子液按质量分数1％的接种量分别接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的100mLTB表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，18℃诱导20h收集菌体，5000g的转速离心收菌。(3)将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(50mmol/LNa2HPO4、50mmol/LNaH2PO4、500mmol/LNaCl、20mmol/Limidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定性提高的纳豆激酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的纳豆激酶的第59位、第218位的一个或两个氨基酸位点进行突变。

【技术特征摘要】
1.一种稳定性提高的纳豆激酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位、第218位的一个或两个氨基酸位点进行突变。2.根据权利要求1所述的突变体，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第218位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位的谷氨酰胺突变为谷氨酸，同时将第218位的天冬酰胺进行突变为天冬氨酸。4.表达权利要求1-3任一所述突变体的重组菌。5.根据权利要求4所述重组菌的构建方法：将纳豆激酶突变体的基因连接在载体pET24a上，以大肠杆菌BL21位宿主，构建重组菌。6.根据权利要求4所述重组菌表达纳豆激酶突变体的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：(1)将重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基，35-38℃、...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，刘中美，周丽，崔文璟，郭军玲，赵菡，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32