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一种耐酸性提高的纳豆激酶制造技术

技术编号:17770197 阅读:136 留言:0更新日期:2018-04-21 22:58
本发明专利技术公开了一种耐酸性提高的纳豆激酶,属于蛋白质工程。本发明专利技术得到的纳豆激酶Q59E‑Y217K‑N218D和Y217K,在酸性条件下,Q59E‑Y217K‑N218D和Y217K的稳定性较野生酶有大幅度提高。本发明专利技术提供的纳豆激酶突变体Q59E‑Y217K‑N218D和Y217K能更好的应对胃道极端酸性环境,提高了纳豆激酶作为治疗心脑血管疾病口服药物的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸性提高的纳豆激酶
本专利技术涉及一种耐酸性提高的纳豆激酶突变体,属于蛋白质工程。
技术介绍
纳豆激酶(NK,EC3.4.21.62),是日本传统食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillusnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶,相较于市售溶栓药物,具有高效溶血栓作用,是最具潜力的纤溶蛋白酶。因此将其开发为可口服药物具有广阔的应用前景,然而由于胃道的极端酸性环境,严重限制了该酶的工业应用。现有的纳豆激酶耐酸性差,急需一种耐酸性提高的纳豆激酶突变体,以适应胃道的极端酸性环境,促进纳豆激酶作为溶栓药物的开发与应用。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种耐酸性提高的纳豆激酶突变体,所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的多个氨基酸位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中,所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位、第217位、第218位的一个或多个氨基酸位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中,所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第217位酪氨酸突变为赖氨酸。在本专利技术的一种实施方式中,所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位谷氨酰胺突变为谷氨酸,同时将第217位酪氨酸突变为赖氨酸和218位天冬酰胺突变为天冬氨酸,得到组合突变体Q59E-Y217K-N218D。本专利技术的第二个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中,所述重组菌的构建方法为:将纳豆激酶突变体的基因连接在载体pET24a上,以大肠杆菌BL21位宿主,构建重组菌。本专利技术的第三个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的方法,具体步骤如下:(1)将重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基,35-38℃、150-250r/min振荡过夜培养得到种子液。(2)将种子液按质量分数为1-2%的接种量分别接种于含卡那霉素浓度的表达培养基中,35-38℃、150-250r/min振荡培养至OD600至0.6-0.8时,加入诱导剂IPTG,于15-18℃诱导18-24h纳豆激酶突变体的表达。在本专利技术的一种实施方式中,所述卡那霉素的浓度为80-120μg/mL。在本专利技术的一种实施方式中,所述诱导剂IPTG至0.05-0.2mM。在本专利技术的一种实施方式中,所述诱导剂IPTG至0.1mM在本专利技术的一种实施方式中,所述表达培养基为TB培养基,所述TB培养基组分为:胰蛋白胨10-14g/L,酵母提取物20-26g/L,甘油3-8g/L,KH2PO42.0-2.6g/L,K2HPO4·3H2O15.8-16.8g/L,CaCl20.15-0.25g/L,余量为水。在本专利技术的一种实施方式中,所述纳豆激酶的纯化过程:将重组菌体破碎后,收集上清,上清膜过滤后,在2-6℃下,用镍柱离心柱分离得到纳豆激酶突变体纯酶液。本专利技术的有益效果:本专利技术提供的纳豆激酶突变体Q59E-Y217K-N218D具有更好的酸性稳定性,尤其在pH4.0条件下处理4h后,野生型WT只剩约25%的酶活,而突变体Y217K保持67%的酶活,突变体Q59E-Y217K-N218D仍能保留约80%的酶活,大幅度提高了纳豆激酶耐酸性。因此,本专利技术提供的纳豆激酶突变体Y217K,Q59E-Y217K-N218D将更适应口服,能更好的应对胃道极端酸性环境。附图说明图1野生酶(WT)和突变体在pH4.0条件下处理4h后的残余酶活。具体实施方式LB培养基组分为:蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L、NaCl8-12g/LTB培养基组分为:胰蛋白胨10-14g/L,酵母提取物20-26g/L,甘油3-8g/L,KH2PO42.0-2.6g/L,K2HPO4·3H2O15.8-16.8g/L,CaCl20.15-0.25g/L酶活的定义:在25℃,pH8.0,底物浓度为0.4mM,1min内,将1μmolsuc-AAPF-pNA转化成1μmolpNA所需的酶量定义为一个酶活力单位。酶活测定方法:在100mMpH8.0Tris-HCl缓冲液(含0.1mMCaCl2),以人工合成的suc-AAPF-pNA为底物,在25℃下反应3min,根据405nm的吸收值测定生成对硝基苯胺(pNA)浓度测定酶活。pH稳定性的确定:将野生酶WT和突变体在pH4缓冲液中于4℃保留4h后测定残留酶活,将最高酶活定义为100%,得到pH稳定性柱状图。实施例1纳豆激酶单突变体和双突变体的构建(1)单突变体Q59E的构建以pET24a-pro-NK为模版,以表1所示引物在表5所示条件下,PCR得到携带编码Q59E突变体基因的重组载体,得到质粒pET24a-pro-NK/Q59E。表1突变体Q59E引物PCR产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定;再将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化,最后用QuichCutTmDpnI于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒,转入BL21大肠杆菌宿主,重组菌命名为BL21/pET24a-pro-NK/Q59E。(2)单突变体Y217K的构建以pET24a-pro-NK为模版,以表2所示引物在表5所示条件下,PCR得到携带编码Y217K突变体基因的重组载体,得到质粒pET24a-pro-NK/Y217K。表2突变体Y217K引物PCR产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定;再将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化,最后用QuichCutTmDpnI于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒,转入BL21大肠杆菌宿主,重组菌命名为BL21/pET24a-pro-NK/Y217K。(3)单突变体N218D的构建以pET24a-pro-NK为模版,以表3所示引物在表5所示条件下,PCR得到携带编码N218D突变体基因的重组载体,得到质粒pET24a-pro-NK/N218D。表3突变体N218D引物PCR产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定;再将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化,最后用QuichCutTmDpnI于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒,转入BL21大肠杆菌宿主,重组菌命名为BL21/pET24a-pro-NK/N218D。(4)双突变体Q59E-N218D的构建以pET24a-pro-NK为模版,以表1所示引物在表5所示条件下,PCR得到携带编码Q59E突变体基因的重组载体;使用质粒小量提取试剂盒按照说明书上步骤提取pET24a-pro-NK/Q59E质粒,再以pET24a-pro-NK/Q59E为模板,以表3所示引物在表5所示条件下,PCR得到携带编码Q59E-N218D双突变体基因的重组载体,质粒命名为pET24a-pro-NK/Q59E-N218D。PCR产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定;再将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化,最后用QuichCutTmDpnI于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒,转入BL21大肠杆菌宿主,重组菌命名为BL21/pET24a-pro-NK/Q59E-N218D。实施例2纳豆激酶三突变体的构建以pET24a-pro-NK为模版,以表1所示引物在表5所示条件下,PCR得到携带编码Q59E突变体基因的重组载体;使用质粒小量提取试剂盒按照说明书上步骤提取pET24a本文档来自技高网...
一种耐酸性提高的纳豆激酶

【技术保护点】
一种稳定性提高的纳豆激酶突变体,其特征在于,所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的纳豆激酶的第59位、第217位、第218位的一个或多个氨基酸位点进行突变。

【技术特征摘要】
1.一种稳定性提高的纳豆激酶突变体,其特征在于,所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位、第217位、第218位的一个或多个氨基酸位点进行突变。2.根据权利要求1所述的突变体,其特征在于,所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第217位酪氨酸突变为赖氨酸。3.根据权利要求1所述的突变体,其特征在于,所述突变体是将氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的纳豆激酶的第59位谷氨酰胺突变为谷氨酸,同时将第217位酪氨酸突变为赖氨酸和218位天冬酰胺突变为天冬氨酸,得到组合突变体Q59E-Y217K-N218D。4.表达权利要求1-3任一所述突变体的重组菌。5.根据权利要求4所述重组菌的构建方法:将纳豆激酶突变体的基因连接在载体pET24a上,以大肠杆菌BL21位宿主,构建重组菌。6.根据权利要求4所述重组菌表达纳豆激酶突变体的方法,其特征在于,所述方法的具体步骤如下:(1)将重组菌...

【专利技术属性】
技术研发人员:周哲敏刘中美周丽崔文璟郭军玲赵菡
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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