一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，属于酶工程以及发酵工程领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：使用黑曲霉孢子液喷洒到柱状活性碳上培养得到活化的柱状活性碳；往发酵罐中加入培养基、活化的柱状活性碳，发酵1.5‑3d；加入活性碳纳米粉末和葡萄糖，发酵1.5‑3d；再次加入活性碳纳米粉末，发酵1‑2d，发酵醪液放出发酵罐，用滤网过滤，滤液为第一批次发酵醪液，滤网上的固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳用于下一批次发酵；重复上述发酵步骤多次。本发明专利技术利用柱状活性碳作为黑曲霉菌丝的载体，同时用活性碳纳米粉末减轻葡萄糖的反馈抑制作用，达到了持续不断高强度产生乙醇耐受纤维素内切酶的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法
本专利技术涉及酶工程以及发酵工程领域，具体涉及一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法。
技术介绍
纤维素酶能降解谷物和薯类中的纤维素转化为可发酵的糖类，同时能促进淀粉酶降解淀粉，从而提高酿酒出酒率。酿酒过程中谷壳或高粱外壳等纤维素的降解能提升酒糟饲料的适口性，促进酒糟饲料的高质开发。纤维素酶对酿酒行业实现“高质、高产、低耗”的生产具有重要的意义。全球每年光合作用产生的纤维素资源超过100亿吨。利用绿色可再生纤维素资源生产乙醇等生物燃料对减缓温室效应、全球可持续发展具有不可估量的意义。纤维素的高效降解是利用纤维素生产乙醇等生物燃料的关键。纤维素酶降解纤维素具有反应条件温和、污染少、效率高等特点，其降解纤维素生产生物燃料具有广阔的应用前景。但是纤维素酶降解纤维素生产生物燃料的成本较高，是亟待突破的现实瓶颈。纤维素酶耐受乙醇分子的改造和生产是降低纤维素生产燃料乙醇成本的关键技术之一。纤维素降解生产燃料乙醇的工艺分为两种：先糖化后发酵与边糖化边发酵。先糖化后发酵工艺为：先利用纤维素酶降解纤维素为葡萄糖，然后加入酒精酵母，利用酒精酵母的代谢把葡萄糖转化为乙醇。该工艺中，纤维素降解产物葡萄糖的反馈抑制作用会大幅度降低纤维素的降解效率。边糖化边发酵工艺为：酒精酵母和纤维素酶同时加入到纤维素原料中，纤维素酶降解纤维素产生的葡萄糖被酵母转化为乙醇。该工艺能解除葡萄糖的反馈抑制作用，但是随着乙醇浓度的增加，乙醇非耐受纤维素酶的降解活性大幅度降低。耐受乙醇纤维素酶能在乙醇溶液中维持较高的降解活性。耐受乙醇的纤维素酶与酵母同步加入到纤维素基质中，不仅能有效解除葡萄糖的反馈抑制作用，而且能在含乙醇的体系中保持较高的降解活性，从而降低纤维素酶降解纤维素生产燃料乙醇的成本。耐受乙醇纤维素酶对降低纤维素生产生物燃料具有重要的实际意义。在液态或固态酿酒时，纤维素酶也处于乙醇含量较高的发酵体系中，耐受乙醇的纤维素酶能更高效降解原料中的纤维素，提高出酒率。纤维素酶是由纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡糖苷酶三种酶组成。纤维素外切酶首先破坏纤维素的晶体结构，把晶体纤维素转化为可溶的纤维素大片段分子。纤维素内切酶降解可溶的纤维素大片段分子，产生纤维二糖，纤维二糖在β-葡糖苷酶的作用下转变为葡萄糖。纤维素酶降解纤维素是一个协同降解的过程。纤维素复合酶系的耐受性取决于纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡糖苷酶三种酶的耐受性。纤维素内切酶在纤维素的降解中，处于降解过程的承接地位，纤维素内切酶的乙醇耐受性是纤维素酶耐受乙醇的关键。已有研究中，为了诱导黑曲霉产生纤维素酶，往往限制碳源的供应，这样黑曲霉的菌丝逐渐衰亡，产酶能力下降。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，通过该方法能够持续不断高强度产生乙醇耐受的纤维素内切酶。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，包括如下步骤：(1)黑曲霉孢子接种柱状活性碳：使用培养基将黑曲霉孢子调为浓度1-1.5×108/mL的孢子液，将孢子液均匀喷洒到灭菌后的柱状活性碳上，在30-35℃培养20-24h，得到初步活化的柱状活性碳。该步骤中，每1.0kg柱状活性碳优选喷洒150-250mL孢子液。(2)第一批次发酵：往发酵罐中加入培养基、初步活化的柱状活性碳，将发酵罐的通气量设为25-35L/min，25-28℃发酵1.5-3d；加入活性碳纳米粉末和葡萄糖，25-28℃发酵1.5-3d；再次加入活性碳纳米粉末，25-28℃发酵1-2d，发酵醪液放出发酵罐，用滤网过滤，滤液为第一批次发酵醪液，滤网上的为固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳。该步骤中，柱状活性碳的用量优选为34-36g/L培养基。(3)多批次发酵：往发酵罐中加入培养基、固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳将发酵罐的通气量设为25-35L/min，25-28℃发酵1.5-3d；加入活性碳纳米粉末和葡萄糖，25-28℃发酵1.5-3d；再次加入活性碳纳米粉末，25-28℃发酵1-2d，发酵醪液放出发酵罐，用滤网过滤，滤液为第二批次发酵醪液，滤网上的为固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳；重复该步骤多次。优选的，所述的方法中，每次活性碳纳米粉末的加入量为0.2-2g/L培养基；葡萄糖的加入量为2-3g/L培养基。更优选的，所述的连续发酵方法进行五批次发酵，发酵过程为：第一批次发酵：往50L气升式发酵罐中加入25L培养基和850g初步活化的柱状活性碳，发酵罐的通气量设为30L/min，28℃发酵2d；加入活性碳纳米粉末50g、葡萄糖50g，补加发酵培养基至起始量，28℃发酵2d；再次加入活性碳纳米粉末17g，补加发酵培养基至起始量，28℃发酵1d，发酵醪液放出发酵罐，用30目筛网过滤，滤液为第一批次发酵醪液，滤网上的为固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳。第二批次发酵：往50L气升式发酵罐中加入25L培养基，将上一批次所得固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳也全部加到气升式发酵罐中，发酵罐的通气量设为30L/min，28℃发酵2d；加入活性碳纳米粉末5g，葡萄糖50g，补加发酵培养基至起始量，28℃发酵2d；再次加入活性碳纳米粉末8g，补加发酵培养基至起始量，28℃发酵1d，发酵醪液放出发酵罐，用30目筛网过滤，滤液为第二批次发酵醪液，滤网上的为固定黑曲霉菌丝的活性碳柱。第三批次发酵、第四批次发酵、第五批次发酵的操作均同第二批次。上述培养基的配方优选为：麸皮30g/L，氯化铵5g/L，磷酸二氢钾2g/L，玉米芯粉12g/L，蛋白胨0.01g/L。上述黑曲霉优选为黑曲霉ATCC16888。本专利技术利用柱状活性碳作为黑曲霉菌丝的载体，同时用活性碳纳米粉末减轻葡萄糖的反馈抑制作用，达到了持续不断高强度产生乙醇耐受纤维素内切酶的目的。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例11、菌株和材料黑曲霉：黑曲霉ATCC16888。柱状活性碳：河南润泉净化材料有限公司，挑选长度2-3cm、直径小于1cm的柱状活性碳。颗粒状活性碳：巩义市龙达水处理材料有限公司，挑选粒径小于2cm的颗粒状活性碳。2、培养基配制PDA斜面培养基：称取马铃薯200g，去皮切成块，加入到1000mL自来水中煮沸20min，之后用纱布过滤；往滤液中加入20g葡萄糖和15g琼脂，115℃灭菌30min，倒斜面。发酵培养基：麸皮30g/L，氯化铵5g/L，磷酸二氢钾2g/L，玉米芯粉12g/L，蛋白胨0.01g/L，5g/L葡萄糖，自然pH，121℃灭菌20min，用灭菌的6层纱布过滤，过滤液即为发酵培养基。3、方法(1)将黑曲霉ATCC16888孢子接种到PDA斜面培养基上，在恒温培养箱中28℃培养4d，待黑曲霉长满斜面且已长出孢子。加发酵培养基到长出孢子的斜面，使孢子的浓度为1×108/mL，得到黑曲霉孢子液。(2)黑曲霉孢子接种柱状活性碳柱状活性碳在115℃灭菌30min，冷却到室温后，平铺于灭菌的纱布上，柱状活性碳铺成单层。用喷雾器喷洒黑曲霉孢子液到柱状活性碳，每1.0kg柱状活性碳喷洒孢子液200mL。喷洒后把活性碳收集于500mL三角瓶内，每瓶装入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)黑曲霉孢子接种柱状活性碳：使用培养基将黑曲霉孢子调为浓度1‑1.5×10

【技术特征摘要】
1.一种乙醇耐受纤维素酶的连续发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)黑曲霉孢子接种柱状活性碳：使用培养基将黑曲霉孢子调为浓度1-1.5×108/mL的孢子液，将孢子液均匀喷洒到灭菌后的柱状活性碳上，在30-35℃培养20-24h，得到初步活化的柱状活性碳；(2)第一批次发酵：往发酵罐中加入培养基、初步活化的柱状活性碳，将发酵罐的通气量设为25-35L/min，25-28℃发酵1.5-3d；加入活性碳纳米粉末和葡萄糖，25-28℃发酵1.5-3d；再次加入活性碳纳米粉末，25-28℃发酵1-2d，发酵醪液放出发酵罐，用滤网过滤，滤液为第一批次发酵醪液，滤网上的为固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳；(3)多批次发酵：往发酵罐中加入培养基、固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳将发酵罐的通气量设为25-35L/min，25-28℃发酵1.5-3d；加入活性碳纳米粉末和葡萄糖，25-28℃发酵1.5-3d；再次加入活性碳纳米粉末，25-28℃发酵1-2d，发酵醪液放出发酵罐，用滤网过滤，滤液为第二批次发酵醪液，滤网上的为固定黑曲霉菌丝的柱状活性碳；重复该步骤多次。2.根据权利要求1所述的连续发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，每1.0kg柱状活性碳喷洒150-250mL孢子液。3.根据权利要求1所述的连续发酵方法，其特征在于：步骤(2)中，柱状活性碳的用量为34-36g/L培养基。4.根据权利要求1所述的连续发酵方法，其特征在于：每次活性碳纳米粉末的加入量为0.2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，曾徐浩，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42