一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法，属于酶工程以及发酵工程领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：使用培养基将黑曲霉孢子调为一定浓度的孢子液，将孢子液均匀喷洒到灭菌后的柱状活性碳上，培养后得到初步活化的柱状活性碳；将初步活化的柱状活性碳加到发酵设备浅盘罐的浅盘中，通入培养基，通过控制空气进口管A、B、C的空气流量促进培养基中氧气的溶解，发酵期间加入葡糖糖以及活性碳纳米粉末，按照一定工艺进行发酵得到发酵醪液；重复发酵多批次。本发明专利技术利用新型的发酵设备、柱状活性碳作为黑曲霉菌丝的载体，以及活性碳纳米粉末减轻葡萄糖的反馈抑制作用，达到了持续不断高强度产生乙醇耐受纤维素内切酶的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法
本专利技术涉及酶工程以及发酵工程领域，具体涉及一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法。
技术介绍
纤维素酶能降解谷物和薯类中的纤维素转化为可发酵的糖类，同时能促进淀粉酶降解淀粉，从而提高酿酒出酒率。酿酒过程中谷壳或高粱外壳等纤维素的降解能提升酒糟饲料的适口性，促进酒糟饲料的高质开发。纤维素酶对酿酒行业实现“高质、高产、低耗”的生产具有重要的意义。全球每年光合作用产生的纤维素资源超过100亿吨。利用绿色可再生纤维素资源生产乙醇等生物燃料对减缓温室效应、全球可持续发展具有不可估量的意义。纤维素的高效降解是利用纤维素生产乙醇等生物燃料的关键。纤维素酶降解纤维素具有反应条件温和、污染少、效率高等特点，其降解纤维素生产生物燃料具有广阔的应用前景。但是纤维素酶降解纤维素生产生物燃料的成本较高，是亟待突破的现实瓶颈。纤维素酶耐受乙醇分子的改造和生产是降低纤维素生产燃料乙醇成本的关键技术之一。纤维素降解生产燃料乙醇的工艺分为两种：先糖化后发酵与边糖化边发酵。先糖化后发酵工艺为：先利用纤维素酶降解纤维素为葡萄糖，然后加入酒精酵母，利用酒精酵母的代谢把葡萄糖转化为乙醇。该工艺中，纤维素降解产物葡萄糖的反馈抑制作用会大幅度降低纤维素的降解效率。边糖化边发酵工艺为：酒精酵母和纤维素酶同时加入到纤维素原料中，纤维素酶降解纤维素产生的葡萄糖被酵母转化为乙醇。该工艺能解除葡萄糖的反馈抑制作用，但是随着乙醇浓度的增加，乙醇非耐受纤维素酶的降解活性大幅度降低。耐受乙醇纤维素酶能在乙醇溶液中维持较高的降解活性。耐受乙醇的纤维素酶与酵母同步加入到纤维素基质中，不仅能有效解除葡萄糖的反馈抑制作用，而且能在含乙醇的体系中保持较高的降解活性，从而降低纤维素酶降解纤维素生产燃料乙醇的成本。耐受乙醇纤维素酶对降低纤维素生产生物燃料具有重要的实际意义。在液态或固态酿酒时，纤维素酶也处于乙醇含量较高的发酵体系中，耐受乙醇的纤维素酶能更高效降解原料中的纤维素，提高出酒率。纤维素酶是由纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡糖苷酶三种酶组成。纤维素外切酶首先破坏纤维素的晶体结构，把晶体纤维素变为可溶的纤维素大片段分子。纤维素内切酶降解可溶的纤维素大片段分子，产生纤维二糖，纤维二糖在β-葡糖苷酶的作用下转变为葡萄糖。纤维素酶降解纤维素是一个协同降解的过程。纤维素复合酶系的耐受性取决于纤维素外切酶、纤维素内切酶、β-葡糖苷酶三种酶的耐受性。纤维素内切酶在纤维素的降解中，处于降解过程的承接地位，纤维素内切酶的乙醇耐受性是纤维素酶耐受乙醇的关键。已有研究中，为了诱导黑曲霉产生纤维素酶，往往限制碳源的供应，这样黑曲霉的菌丝逐渐衰亡，产酶能力下降。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法及发酵设备，通过该方法能够持续不断高强度产生乙醇耐受的纤维素内切酶。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法，包括如下步骤：(1)黑曲霉孢子接种柱状活性碳使用培养基将黑曲霉孢子调为浓度1-1.5×108/mL的孢子液，将孢子液均匀喷洒到灭菌后的柱状活性碳上，在30-35℃培养20-24h，得到初步活化的柱状活性碳。该步骤中，每1.0kg柱状活性碳优选喷洒150-250mL孢子液。(2)使用发酵设备浅盘罐进行发酵第一批次发酵：从固体物料加入管接入初步活化的柱状活性碳到浅盘中。开启涡轮泵一，打开进口阀，向第一个浅盘中加入发酵培养基，当浅盘的培养基溢出后，停止向第一个浅盘加入培养基，开始向第二个浅盘加入培养基，依次类推，所有浅盘都加满培养基，当浅盘罐底部发酵培养基液面达到标准线时，开启出口阀，让所有管道内充满发酵培养基，关闭进口阀。涡轮泵二一直开启，让发酵培养基的流速为25-30L/min，同时开启空气进口管A、B、C的阀门，调节空气流量，将空气进口管A通气量调为8-10L/min、空气进口管B通气量调为3-4L/min、空气进口管C通气量调为2-3L/min，发酵1.5-2d；从液体进口管向整个发酵体系加入葡糖糖使其浓度达到2-3g/L，加入活性碳纳米粉末使其浓度达到40-50g/L，将空气进口管A通气量调为6-8L/min、空气进口管B通气量调为2-3L/min、空气进口管C通气量调为0.5-1L/min，发酵2-3d；从液体进口管向整个发酵体系加入葡糖糖使其浓度达到2-3g/L，加入活性碳纳米粉末使其浓度达到40-50g/L，将空气进口管A通气量调为4-5L/min，空气进口管B通气量调为1-1.5L/min，空气进口管C通气量调为0.5-0.6L/min，发酵1-2d，得到成熟的发酵醪液，打开出料口，放出第一批次发酵醪液，活化的柱状活性碳被滤网拦截在浅盘中用于下一批次的发酵。发酵期间，控制温度为25-30℃。按照第一批次发酵的操作，进行第二批次、第三批次、第四批次、第五批次发酵。步骤(2)中所述的发酵培养基的配制优选为：麸皮30g/L，氯化铵5g/L，磷酸二氢钾2g/L，玉米芯粉12g/L，蛋白胨0.01g/L，自然pH，灭菌后过滤，滤液即为发酵培养基。步骤(2)中所述的发酵设备浅盘罐，包括罐体。所述罐体内部一侧固定安装有多个浅盘，所述罐体内部另一侧与浅盘不接触。所述浅盘靠近罐体另一侧的边缘内部设有滤网。所述罐体底部设有蒸汽进口管、顶部设有蒸汽出口管用于灭菌，所述蒸汽进口管、蒸汽出口管均设有单向阀。所述罐体底部一侧通过软管一依次连接有出口阀、涡轮泵二、出料口，所述出料口设有单向阀。所述软管一的末端连接混合喷射结构，所述混合喷射结构由通过管道连接的混合喷射结构A、B、C组成。所述混合喷射结构A包括喷射腔大膨胀室A、喷射腔小膨胀室A；所述喷射腔大膨胀室A连接有空气进口管A用于通入无菌空气；所述喷射腔大膨胀室A还连接有液体进口管用于通入培养基或其他液体(如酸碱液、灭菌水)，液体进口管上设有涡轮泵一、进口阀。所述混合喷射结构B包括喷射腔大膨胀室B、喷射腔小膨胀室B，所述喷射腔大膨胀室B上连接有空气进口管B用于通入无菌空气。所述混合喷射结构C包括喷射腔大膨胀室C，喷射腔大膨胀室C上连接有空气进口管C用于通入无菌空气。所述空气进口管A、空气进口管B、空气进口管C均设有空气过滤器、空气流量计和空气流量调节阀。所述混合喷射结构C的出口端通过多根软管二分别穿过罐体与浅盘连通，所述软管二设有单向阀。所述罐体上还设有多根穿过罐体与浅盘连通的固体物料加入管，所述固体物料加入管设有隔膜阀，在加入固体物料后关闭隔膜阀。优选的，所述浅盘在竖直方向上等间距安装。优选的，所述软管一上套有管套，所述管套有设有热水进口、热水出口，通过通入一定温度的水以维持软管一中培养液的温度。优选的，所述软管一、软管二为不锈钢软管，直径分别为7cm、2cm；所述固体物料加入管为直径3cm的不锈钢管。所述罐体、浅盘用3cm厚的A3型不锈钢加工而成。所述罐体内部距离罐底7-10cm为标准线。所述发酵设备的排料方式为：发酵结束后，开启涡轮泵二，打开出料口，等到罐体底部液体排空，关闭涡轮泵二，关闭出料口。倾斜罐体成一定角度使浅盘中的发酵液流出，再次开启涡轮泵二，打开出料口，直到罐液体被全部排放出。本专利技术利用新型的发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)黑曲霉孢子接种柱状活性碳使用培养基将黑曲霉孢子调为浓度1‑1.5×10

【技术特征摘要】
1.一种乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)黑曲霉孢子接种柱状活性碳使用培养基将黑曲霉孢子调为浓度1-1.5×108/mL的孢子液，将孢子液均匀喷洒到灭菌后的柱状活性碳上，在30-35℃培养20-24h，得到初步活化的柱状活性碳；(2)使用发酵设备浅盘罐进行发酵第一批次发酵：从固体物料加入管接入初步活化的柱状活性碳到浅盘中；开启涡轮泵一，打开进口阀，向第一个浅盘中加入发酵培养基，当浅盘的培养基溢出后，停止向第一个浅盘加入培养基，开始向第二个浅盘加入培养基，依次类推，所有浅盘都加满培养基，当浅盘罐底部发酵培养基液面达到标准线时，开启出口阀，让所有管道内充满发酵培养基，关闭进口阀；涡轮泵二一直开启，让发酵培养基的流速为25-30L/min，同时开启空气进口管A、B、C的阀门，调节空气流量，将空气进口管A通气量调为8-10L/min、空气进口管B通气量调为3-4L/min、空气进口管C通气量调为2-3L/min，发酵1.5-2d；从液体进口管向整个发酵体系加入葡糖糖使其浓度达到2-3g/L，加入活性碳纳米粉末使其浓度达到40-50g/L，将空气进口管A通气量调为6-8L/min、空气进口管B通气量调为2-3L/min、空气进口管C通气量调为0.5-1L/min，发酵2-3d；从液体进口管向整个发酵体系加入葡糖糖使其浓度达到2-3g/L，加入活性碳纳米粉末使其浓度达到40-50g/L，将空气进口管A通气量调为4-5L/min，空气进口管B通气量调为1-1.5L/min，空气进口管C通气量调为0.5-0.6L/min，发酵1-2d，得到成熟的发酵醪液，打开出料口，放出第一批次发酵醪液，活化的柱状活性碳被滤网拦截在浅盘中用于下一批次的发酵；按照第一批次发酵的操作，进行第二批次、第三批次、第四批次、第五批次发酵。2.根据权利要求1所述的乙醇耐受纤维素内切酶的连续多批次发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，每1.0kg柱状活性碳喷洒150-250mL孢子液。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，曾徐浩，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42