一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种β‑半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。通过将β‑半乳糖苷酶中的特定位点氨基酸进行突变，转入重组菌后，并在优化后的条件下进行酶转化，突变体生产的低聚半乳糖产率达到59.8％，较野生酶提高70％左右，实现了低聚半乳糖产量的提高，具有极高的工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
低聚半乳糖(GOS)是一种功能性低聚糖，目前广泛应用于食品行业。GOS作为一种新型的功能性食品添加剂，因其独有的生理功能及卓越的物化性质，现已引起全世界的广泛重视。随着GOS开发研究的不断深入,加之我国原材料的丰富,消费市场的无限潜力，GOS的生产在全国已经掀起强烈的势头。目前，我国的低聚糖生产还属新兴行业，GOS的开发还未形成规模，制约我国GOS生产的主要是缺乏性能优良的工业酶，因此，寻找性能优良的工业酶至关重要。β-半乳糖苷酶是工业酶法生产低聚半乳糖的主要用酶。不同微生物来源的β-半乳糖苷酶由于本身性质不同，生成GOS的能力也不同。目前已知的较好的生产GOS的菌株有B.circulans、KluyveromycesLactis、A.oryzae。尽管B.circulans(环状芽孢杆菌)的产率较高，为48.3％，但其生产GOS的产物主要是4'GalLac，其益生效果较差。而作为食品安全菌株的A.oryzae,其生产的GOS主要产物是6'GalLac，6'GalLac比4'GalLac益生效果更好，但其产率只有19％左右，大大限制了它的应用。因此，提高米曲霉来源β-半乳糖苷酶的GOS产率，为其工业化生产创造条件，是目前要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶的突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的第140位、第264位、第304位、第806位的氨基酸中的一个或多个位点进行突变。在本专利技术的一种实施方式中所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示β-半乳糖苷酶的第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，突变体命名为F264W。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示β-半乳糖苷酶的第304位置的苯丙氨酸(Phe)变成谷氨酰胺(Gln)，突变体命名为F304Q。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示β-半乳糖苷酶的第806位置的色氨酸(Trp)变成苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为W806F。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，将第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C/F264W。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示β-半乳糖苷酶的第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，将第806位置的色氨酸(Trp)变成苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为N140C/W806F。专利技术的第二个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶的突变体的制备方法，具体步骤如下：(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带β-半乳糖苷酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体。(2)将突变体质粒转化进宿主细胞。(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心，上清液即为β-半乳糖苷酶突变体的粗酶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒载体是pET系列或pPIC9k中的任意一种。专利技术的第三个目的是提供了一种β-半乳糖苷酶的突变体的制备低聚半乳糖的方法，具体步骤如下：(1)以400g/L-600g/L浓度的乳糖为底物，加入β-半乳糖苷酶，加入醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为4.5-5；(2)酶转化在水浴摇床进行，反应温度为40-60℃；(3)反应在5-36h内进行，期间每隔4小时取一次样；(4)反应产物进行液相分析，计算产率。在本专利技术的一种实施方式中，所述β-半乳糖苷酶添加量为2.5-5U/mL。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了米曲霉来源的β-半乳糖苷酶的突变体，使得转化乳糖产GOS产率从野生菌的35.2％最高提高到了59.8％，解决了此酶工业生产产率较低的问题。此酶相对野生型，转苷活性更强，适用于工业生产。本专利技术应用于低聚半乳糖GOS生产，生产的最佳pH是4.5，最优温度是40℃，更适合工业化生产。本专利技术在构建的突变体的基础上，对酶转化生产低聚半乳糖GOS进行了优化，使其具有更高的工业生产价值。在最优条件下进行酶转化，产率达到59.8％，比野生型提高70％左右。附图说明图1利用野生酶与突变体转化乳糖生低聚半乳糖的最适温度；图2利用野生型与突变体转化乳糖生低聚半乳糖的最适pH。具体实施方式BMGY液体培养基：YNB：13.4g/L；酵母膏：10g/L；蛋白胨：20g/L；甘油：10g/L；K2HPO4：2.29g/L；KH2PO4:11.8g/L；(NH4)2SO4：10g/L；BMMY液体培养基：YNB：13.4g/L；酵母膏：10g/L；蛋白胨：20g/L；甲醇：40g/L；K2HPO4：2.29g/L；KH2PO4:11.8g/L；(NH4)2SO4：10g/L。酶活测定方法：β-半乳糖苷酶活性分析用邻硝基苯酚-β-D-半乳吡喃糖苷(oNPG)作底物。配制20mmol/LoNPG，取100μL适当稀释的发酵液或酶液、1800μL0.1mol/LpH4.5的醋酸钠缓冲液在60℃保温5min后，加入100μL底物，于60℃保温10min，立即加入1mL1mol/L预冷的Na2CO3溶液中止反应并显色，用分光光度计在420nm处测定吸光值。酶活力单位定义：在上述分析条件下，每分钟催化产生1μmoloNP的酶量为一个活力单位。HPLC方法分析低聚半乳糖GOS产率配置60％(W/V)乳糖溶液作为底物，加入一定量的野生酶和双突变体酶液，使得野生型酶液的最终酶活为10U/mL，突变体的最终酶活为2.5U/mL(之前做过加酶量对GOS生产的影响，以上条件分别为突变体及野生型的最适加酶量)。在最适温度及pH条件下进行反应，野生型反应10h(预实验中野生型最高产率的时间)，突变体反应5h(预实验中突变体最高产率的时间)，反应液12000rpm离心10min，取上清，用0.22nm超滤膜过滤后去20uL上HPLC分析。反应液中，二糖，三糖，四糖，五糖在产物中的量采用HPLC来分析。测定的色谱条件为：Agilent1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱Hi-PlexNa,(300×7.7mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相为纯水，流速为0.3mL/min，柱温设定为80℃。测定二糖的色谱条件为：Agilent1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱NH2-504E(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相采用78％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8mL/min，柱温设定为35℃。低聚半乳糖产率本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑半乳糖苷酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β‑半乳糖苷酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。

【技术特征摘要】
1.一种β-半乳糖苷酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是将将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的第140位、第264位、第304位、第806位的氨基酸中的一个或多个位点进行突变。3.根据权利要求1所述突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(d)：(a)将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C；(b)将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，突变体命名为F264W；(c)将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的第304位置的苯丙氨酸(Phe)变成谷氨酰胺(Gln)，突变体命名为F304Q；(d)将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-半乳糖苷酶的第806位置的色氨酸(Trp)变成苯丙氨酸(Phe)，突变体命名为W806F；(e)突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示β-半乳糖苷酶的第264位置的苯丙氨酸(Phe)变成色氨酸(Trp)，将第140位置的天冬酰胺(Asn)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为N140C/F264W；(f...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，吴丹，高鑫，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32