NBS320型生物反应器固定床灌流培养制备RABV‑dG株狂犬病病毒液的方法技术

本发明专利技术公开一种应用NBS320型生物反应器固定床灌流培养技术制备高滴度RABV‑dG株狂犬病病毒液的工艺方法，具体涉及使用NBS320型生物反应器培养Vero细胞过程中溶氧、pH值、温度、转速、气流量的参数组合；病毒接种量，从而获得高滴度的RABV‑dG株狂犬病病毒液。

【技术实现步骤摘要】
NBS320型生物反应器固定床灌流培养制备RABV-dG株狂犬病病毒液的方法
本专利技术涉及生物制品
，特别是一种应用固定床技术灌流培养Vero细胞，通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量五参数的组合控制制备高滴度RABV-dG株狂犬病病毒液的方法。
技术介绍
狂犬病是一种十分重要的人兽共患传染性疾病，包括人在内的几乎所有哺乳动物都易感。但狂犬病是一种疫苗可防控的疾病，在许多国家，动物(大部分是犬)疫苗接种降低了人类狂犬病发病数量。因此，安全、有效、经济适用的狂犬病疫苗是十分重要的。Vero细胞是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质，因此采用Vero细胞做为生产基质制备狂犬病疫苗是目前主要采用的工艺。早期Vero细胞培养狂犬病病毒多数采用转瓶生产，通过增加Vero贴附面积，也就是增加转瓶数量来扩大培养规模，而如今生物反应器的发展，固定床技术成为大规模细胞培养的新方法，固定床技术即将纤维网状的片状载体填料固定于生物反应器罐体内形成固定的床层，使细胞能够贴附在载体内生长的技术，该技术操作简单易控，可培养高密度细胞，使用的片状载体可吸附脱落的细胞核宿主蛋白，易得到高质量的收获液。此外，灌流式培养是一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应器液体不断取出，使培养环境相对稳定；通过调节灌流速率，将反映细胞代谢活性的某一环境变量控制在设定点；可以更精确地控制培养液中的各种营养物质的浓度，使得细胞密度和目标产物浓度大幅提高。此外，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。2010年，美国、欧盟和日本等发达国家将全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清培养工艺生产的生物技术新药的申报受理，因此采用无血清无动物源性培养基VP-SFM替代传统的含血清基础培养基，能够消除因血清、胰酶等动物来源物质及批次差异给产品带来的不确定性，简化下游的纯化工艺，有利于提高产品质量和稳定性。
技术实现思路
为了获得高滴度的RABV-dG株狂犬病病毒液，本专利技术经过试验提供一套使用NBS320型生物反应器固定床培养Vero细胞获得高滴度病毒液的参数组合。其特征在于，包括以下步骤：a)用添加有4mML-谷氨酰胺、添加体积比5％～10％新生牛血清、pH值被调节为7.2-7.4的VP-SFM培养基培养Vero细胞；b)使用NBS320型生物反应器，在14L罐体(工作体积10L)固定床提篮内添加300g片状载体(购自NBS公司)，连接常规进液、补液、补碱、废液等管道，连同细胞接种瓶、补液瓶、碱液瓶及废液瓶，对上述进行常规高压蒸汽灭菌后将各管道对应无菌连接，接上O2、N2、Air、CO2气体软管；c)将步骤a)中培养的Vero细胞经消化后接种至步骤b)中的生物反应器中，接种量为5.0×108个/L-9.0×108个/L培养液，设置并控制溶氧60±2％、pH值7.0±0.1、温度37±0.2℃、转速85±5rpm、气流量0.1L/min，进行细胞培养；d)细胞接种10-20h后，开始使用添加有4mML-谷氨酰胺、体积比5％～10％新生牛血清、pH值被调节为7.2-7.8的VP-SFM培养基灌流培养，灌流量(进液量＝出液量，即灌流量)每天提高，依次为2L、5L、10L、10L，反应器内培养体积恒定；e)细胞接种后3-4天，按0.05±0.02MOI加入RABV-dG株狂犬病病毒，调整参数为溶氧50±1％、pH值7.4±0.02、温度34±0.2℃、转速115±5rpm、气流量0.1±0.05L/min，吸附6-12小时后开始灌流培养，灌流液为添加有4mML-谷氨酰胺、pH值被调节为7.2-7.8的VP-SFM培养基，灌流量为每天10L；f)病毒接种64±8小时后开始收获病毒液，每天收获10L，连续收获14-20天；g)对每天收获的病毒液进行滴度检测，用于比较其他参数下获得的病毒液滴度。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1生物反应器培养狂犬病病毒1.材料Vero细胞、谷氨酰胺、VP-SFM培养基、胰蛋白酶消化液、固定床篮式搅拌系统、片状载体、生化检测分析仪2.方法Vero细胞使用含4mML-谷氨酰胺的VP-SFM培养基培养，经T225细胞瓶多次放大培养后，接种入14L(工作体积10L)生物反应器(片状载体300g)，接种量为7.0×108个/L培养液，同时接种入反应器时，加入5％血清。调整生物反应器的参数为溶氧60％、pH值7.0、温度37℃、转速90rpm、气流量0.1L/min，培养16h后，开始使用无血清培养基灌流培养，灌流量每天5-10L。检测葡萄糖含量。细胞接种后第4天，根据消耗的葡萄糖量计算细胞总数，按MOI＝0.1接种RABV-dG株狂犬病病毒，停止灌流。培养10小时后，调整参数为溶氧50％、pH值7.4、温度34℃、转速120rpm、气流量0.1L/min，，继续灌流培养，细胞接种病毒48小时后开始收获病毒液，连续收获18天，共收获180升病毒液。收获的病毒滴度为2×106.5TCID50/ml以上，在接种病毒后3-9天为病毒高峰期，滴度达2×107.5TCID50/ml以上，可连续收获病毒至18天。检定方法见中国药典第101页2.2.3项。同等细胞数量下，在细胞培养阶段和接种病毒后阶段参数均为溶氧60％、pH值7.0、温度37℃、转速110rpm、气流量0.1L/min产生的病毒液滴度在2×104.0TCID50/ml-2×105.0TCID50/ml之间，使用本专利技术中提供的两组参数组合产生的病毒液滴度是普通参数的100倍以上，可以为下步的病毒纯化节约时间和成本。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用NBS320型生物反应器固定床灌流培养技术培养Vero细胞制备高滴度RABV‑dG株狂犬病病毒液的方法，通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的调整组合获得高密度状态良好的Vero细胞，以一定的比例接种RABV‑dG株狂犬病病毒，然后通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的组合调整获得高滴度RABV‑dG株狂犬病病毒液，其特征在于，包括以下步骤：a)用添加有4mM L‑谷氨酰胺、体积比5％～10％新生牛血清、pH值被调节为7.2‑7.4的VP‑SFM培养基培养Vero细胞；b)使用NBS320型生物反应器，在罐体固定床提篮内添加片状载体，连接常规进液、补液、补碱、废液等管道，连同细胞接种瓶、补液瓶、碱液瓶及废液瓶，对上述进行常规高压蒸汽灭菌后将各管道对应无菌连接，接上O2、N2、Air、CO2气体软管；c)将步骤a)中培养的Vero细胞经消化后接种至步骤b)中的生物反应器中，接种量为5.0×10

【技术特征摘要】
1.一种应用NBS320型生物反应器固定床灌流培养技术培养Vero细胞制备高滴度RABV-dG株狂犬病病毒液的方法，通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的调整组合获得高密度状态良好的Vero细胞，以一定的比例接种RABV-dG株狂犬病病毒，然后通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的组合调整获得高滴度RABV-dG株狂犬病病毒液，其特征在于，包括以下步骤：a)用添加有4mML-谷氨酰胺、体积比5％～10％新生牛血清、pH值被调节为7.2-7.4的VP-SFM培养基培养Vero细胞；b)使用NBS320型生物反应器，在罐体固定床提篮内添加片状载体，连接常规进液、补液、补碱、废液等管道，连同细胞接种瓶、补液瓶、碱液瓶及废液瓶，对上述进行常规高压蒸汽灭菌后将各管道对应无菌连接，接上O2、N2、Air、CO2气体软管；c)将步骤a)中培养的Vero细胞经消化后接种至步骤b)中的生物反应器中，接种量为5.0×108个/L-9.0×108个/L培养液，设置并控制溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数，进行细胞培养；d)细胞接种10-20h后，开始使用添加有4mML-谷氨酰胺、体积比5％～10％新生牛血清、pH值被调节为7.2-7.4的VP-SFM培养基灌流...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏振强，金宏丽，殷玉和，石晶，赵健，刘冰，陈宪平，刘伟，夏晓红，
申请(专利权)人：长春西诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22