一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞，其具有CD4

【技术实现步骤摘要】
一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞及其制备方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞及其制备方法。
技术介绍
调节性T细胞(Regulatorycell，Treg)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，可分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg)和诱导产生的适应性调节性T细胞(aTreg或iTreg)。自然调节T细胞直接来源于胸腺，也可经TGF-β诱导产生，通过细胞与细胞间的接触发挥免疫抑制功能。在保持体内免疫系统稳定，预防和治疗自身免疫疾病等方面发挥着重要作用。但是越来越多的证据表明，nTreg在治疗炎症及自身免疫疾病模型中会出现不稳定性，同时失去其免疫抑制功能。nTreg在炎症细胞因子白介素6(IL-6)的作用下，会向Th17细胞分化，并丢失特征性的转录因子Foxp3，从而丧失免疫抑制能力。而且，由nTreg分化而来的Th17细胞可能会成为致病细胞，加重炎症免疫性疾病的发生和发展。nTreg在炎症状态下的不稳定性，极大地制约了其在炎症免疫性疾病中临床应用。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞，其在炎症状态下能抵抗向Th17细胞分化，保持免疫抑制功能。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞，其具有CD4+CD126-Foxp3+的免疫表型。所述炎症状态下的稳定型调节性T细胞免疫表型为CD4+CD126-Foxp3+，其在炎症状态下能抵抗向Th17细胞分化，从而保持免疫抑制功能。本专利技术的另一目的，在于提供所述炎症状态下的稳定型调节性T细胞的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得Foxp3上带有荧光标记的转基因小鼠的脾脏细胞悬液；(2)从步骤(1)的细胞悬液中分离出CD4+T细胞；(3)向步骤(2)获得的CD4+T细胞中加入anti-mouseCD4抗体和anti-mouseCD126抗体标记，分选得到所述CD4+CD126-Foxp3+调节性T细胞。优选地，所述步骤(1)中使用Foxp3上带有GFP荧光标记的转基因小鼠。优选地，所述步骤(1)中获得小鼠脾脏细胞悬液的方法为：取小鼠脾脏，研磨后离心，取细胞沉淀，加入裂解液去除红细胞，离心，利用细胞培养液重悬细胞沉淀，获得所述脾脏细胞悬液。优选地，所述步骤(2)中分离CD4+T细胞的方法为磁激活细胞分选技术或流式细胞分选技术。优选地，所述步骤(3)中加入anti-mouseCD4抗体和anti-mouseCD126抗体后，将细胞置于4℃避光孵育30min，然后利用流式细胞分选仪分选得到所述CD4+CD126-Foxp3+调节T细胞。Foxp3为细胞内蛋白，若使用破膜标记的方法标记Foxp3会导致细胞死亡，无法获得活的CD4+CD126-Foxp3+调节T细胞。因此，本申请直接使用Foxp3上带有荧光标记的转基因小鼠，可能保证分选得到的CD4+CD126-Foxp3+调节T细胞为活细胞，以便后续的研究或使用。本专利技术的又一目的，在于提供所述炎症状态下的稳定型调节性T细胞在制备治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病或器官移植的免疫排斥疾病的药物中的用途。本专利技术的又一目的，在于提供一种药物，所述药物含有上述炎症状态下的稳定型调节性T细胞。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的炎症状态下的稳定型调节性T细胞具有CD4+CD126-Foxp3+免疫表型，克服了自然调节性T细胞的缺陷，在炎症状态下能抵抗向Th17细胞分化，保持免疫抑制功能。利用本专利技术制备方法制备得到的CD4+CD126-Foxp3+调节T细胞可有效治疗与免疫相关的疾病，包括炎症性疾病、自身免疫性疾病和器官移植的免疫排斥疾病。附图说明图1为CD4+CD126-Foxp3+调节性T细胞的流式分选图，其中，P3代表CD4+CD126-Foxp3+细胞群；P4代表CD4+CD126+Foxp3+细胞群。图2为体外炎症状态下CD4+CD126-Foxp3+细胞群和CD4+CD126+Foxp3+细胞群向Th17细胞分化的实验结果图。图3为体外炎症状态下CD4+CD126-Foxp3+细胞群和CD4+CD126+Foxp3+细胞群对CD25-T细胞的增殖功能抑制实验结果图。图4为CD4+CD126-Foxp3+细胞群和CD4+CD126+Foxp3+细胞群对肠炎模型小鼠治疗后的体重增长和结肠病理检测结果图。图5为肠炎模型小鼠体内CD4+CD126-细胞群和CD4+CD126+细胞群上Foxp3的表达水平检测结果图，其中，SP代表脾脏；LN代表淋巴结。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术所述制备炎症状态下稳定型的CD4+CD126-Foxp3+调节性T细胞的方法的一种实施例，使用Foxp3上带有GFP荧光标记的小鼠，下文中利用Foxp3gfp来表示Foxp3上带有GFP荧光标记。本实施例所述制备炎症状态下稳定型的CD4+CD126-Foxp3+调节性T细胞的方法，包括以下步骤：(1)颈椎脱臼处死B6背景的Foxp3gfp小鼠，取小鼠脾脏，轻轻研磨后将研磨液于1500rpm/min条件下离心5min，弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，室温裂解5min后终止裂解，于1500rpm/min条件下离心5min，弃上清，向细胞沉淀中加入1640培养液重悬，获得小鼠脾脏细胞悬液；(2)向步骤(1)的细胞悬液中加入anti-mousebiotinCD4抗体和anti-biotin磁珠，4℃避光孵育30min后，利用MiltenyiAutoMACS分选得到CD4+T细胞；(3)向步骤(2)获得的CD4+T细胞中加入Percpcy5.5标记的anti-mouseCD4抗体和APC标记的anti-mouseCD126，4℃避光孵育30min后，利用流式细胞分选仪(BD公司)分选得到所述CD4+CD126-Foxp3gfp+调节性T细胞。实施例2为了研究CD4+CD126-Foxp3+调节性T细胞在炎症状态下的稳定性，本实施例对CD4+CD126-Foxp3+细胞群和CD4+CD126+Foxp3+细胞群在体外炎症状态向Th17细胞转化的稳定性进行实验。(一)实验方法1、利用实施例1所述方法制备CD4+CD126-Foxp3+细胞群，分选过程中同时收集CD4+CD126+Foxp3+细胞群。2、将分选出来的CD4+CD126-Foxp3+细胞群及CD4+CD126+Foxp3+细胞群培养于96孔板中，接种量为0.3million个细胞/孔。在培养体系中分别加入anti-mouseCD3(终浓度1ug/mL)、anti-mouseCD28(终浓度1ug/mL)、rmIL-6(终浓度20ng/mL)、anti-mouseIFN-r(终浓度5ug/mL)、anti-mouseIL-4(终浓度5ug/mL)、和irradiatedAPC(0.3million)。3、培养三天后收集细胞，利用流式胞内染色法检测IL-17的含量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞，其特征在于，具有CD4

【技术特征摘要】
1.一种炎症状态下的稳定型调节性T细胞，其特征在于，具有CD4+CD126-Foxp3+的免疫表型。2.一种如权利要求1所述的炎症状态下的稳定型调节性T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得Foxp3上带有荧光标记的转基因小鼠的脾脏细胞悬液；(2)从步骤(1)的细胞悬液中分离出CD4+T细胞；(3)向步骤(2)获得的CD4+T细胞中加入anti-mouseCD4抗体和anti-mouseCD126抗体标记，分选得到所述CD4+CD126-Foxp3+调节性T细胞。3.根据权利要求2所述的炎症状态下的稳定型调节性T细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用Foxp3上带有GFP荧光标记的转基因小鼠。4.根据权利要求2所述的炎症状态下的稳定型调节性T细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中获得小鼠脾脏细胞悬液的方法为：取小鼠脾脏，研...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑颂国，王菊华，徐振建，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东,44