猪PLIN2基因超表达的PK‑15细胞株及扩增PCV2病毒的方法技术

技术编号:17770149 阅读:129 留言:0更新日期:2018-04-21 22:56
本发明专利技术提供了一株超表达PLIN2的PK‑15细胞株,该细胞的制备方法以及用该细胞产生高效价PCV2病毒的方法。本发明专利技术的细胞株对PCV2病毒易感,是制备该病毒的高效率扩增细胞。

【技术实现步骤摘要】
猪PLIN2基因超表达的PK‐15细胞株及扩增PCV2病毒的方法专利技术所属领域本专利技术属于细胞工程与病毒培养
,具体地说,本专利技术涉及一种能大幅度提高猪圆环病毒2型(PCV2)培养效价的重组细胞株,制备方法及培养高效价PCV2病毒方法。技术背景目前国内正在使用的猪圆环病毒疫苗主要有2种----亚单位苗和全病毒疫苗,亚单位苗虽安全性较好,但生产成本高昂,免疫期短。因此国内绝大部分猪场仍以全病毒疫苗为主。但全病毒疫苗生产亦有其技术瓶颈:病毒培养效价很难上升到理想状态,为解决该难题,疫苗生产者都在其培养工艺中增加一个用D-氨基葡萄糖处理,使细胞停留于分裂Ⅱ期,保证病毒扩增的程序。但该程序不仅增加了原材料投入,而且增多了生产环节和人力投入,增加了废弃物排放量,使生产成本至少增加1倍以上。即便如此,国内许多厂家生产的圆环病毒疫苗,其病毒效价在104以下,免疫效果较差。欧美国家采取筛选对圆环病毒高度敏感细胞系,培养圆环病毒以及进行病毒浓缩,其病毒含量均在106以上,免疫效果较好,但其生产成本高昂,销售价格往往是国产疫苗的3-5倍。因此如何提高圆环病毒的培养效价而又降低生产成本是国内厂家目前提高圆环病毒疫苗竞争能力的主攻方向。PLIN即脂滴包被蛋白是分布于脂滴表面的含量最多的围脂滴蛋白。最早在附睾脂肪细胞中发现,是脂肪分解调控中的分子开关。PLIN2基因是PLIN家族中的一员,猪PLIN2基因在体内参与动物或细胞的脂类代谢。但关于该基因对圆环病毒增殖的影响至今尚未见文献报道。本专利技术的
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足,提供一种对PCV2病毒易感,且能大幅提高PCV2培养效价的转基因PK-15细胞株。本专利技术的再一个目的是提供一种制备PCV2病毒的方法。本专利技术的另一个目的是提供扩增的PCV2病毒在制备PCV2疫苗中的应用。本专利技术公开了一种超表达猪PLIN2基因的PK-15细胞株,其特征是:PK-15细胞含有人工转染的外源猪PLIN2基因,且PLIN2基因具有SEQIDNO:35所示的核苷酸序列,该细胞对PCV2病毒易感,且能产生效价达到10-7以上的病毒,该细胞是猪肾PK‐15/PLIN2细胞株,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:C2017251。本专利技术还公开了制备PK‐15/PLIN2细胞株的方法,该方法包括如下步骤:1)PLIN2基因的克隆:根据PLIN2基因序列设计重叠PCR引物,共计34条,相邻引物之间有17bp反向互补重叠,中间有25bp未互补序列,34条引物拼接成PLIN2基因的全长,将34条引物混合后经过退火处理,相邻引物的17bp序列互补配对。中间未配对的25bp序列,在高保真酶的作用下序列被补齐,构成完整的双链PLIN2基因的全长序列,经过25个循环后,PLIN2基因得到扩增,然后将扩增获得的片段经电泳检测;2)利用胶回收试剂盒将扩增获得的PLN2基因片段回收,然后用将该片段与pCDNA3.1-EGFP载体分别经NheI和AflII限制性内切酶酶切,电泳检测回收目的片段后经T4连接酶连接至pCDNA3.1-EGFP载体中,构建成pCDNA3.1-EGFP-PLIN2质粒,并经测序验证;3)转染与筛选:转染质粒PLIN2-pCDNA3.1-EGFP至PK-15细胞系,单个细胞克隆化培养法筛选出稳定复制外源PLIN2的PK‐15/PLIN2细胞株。本专利技术进一步公开了制备PCV2的方法,该方法包括如下步骤:1)细胞制备:将PK-15/PLIN2细胞株解冻,培养于克氏瓶中,传代至所需数量;2)病毒接种:同步接种法将PCV2病毒接种于PK-15/PLIN2细胞株上,继续培养24小时;3)病毒培养:24小时后,将培养基更换为含2%胎牛血清的维持液继续培养72小时;4)收获病毒:收获步骤(3)中的培养上清液,并进行PCV2毒价测定,病毒效价能达到10-7以上。具体的本专利技术的目的通过下述技术方案实现:1、含有猪PLIN2基因的PK-15细胞株的制备1.1引物设计与合成根据靶基因PLIN2序列及重叠PCR原理设计引物,序列如下(见表1),引物序列特征为:编号为单号的引物与PLIN2基因序列(5'->3')方向一致,编号为双号的引物与PLIN2基因序列(5'->3')反向互补,另外相邻编号的序列之间存在17bp重叠。第一条序列的前20bp为载体的同源序列与载体序列一致。最后一条序列的后20bp为载体的同源序列与载体序列一致。表1引物列表待引物合成后用去离子水稀释至50pmol/μl,适当离心混合均匀。1.2基因扩增在冰上按表2配制反应体系,混匀后放入PCR仪,34条引物的相邻引物之间有17bp反向互补,每条引物中间有25bp未互补序列(18-42bp位置),34条引物涵盖了PLIN2基因的全长。将34条引物混合后经过退火处理(55℃,1min),相邻引物的17bp序列互补配对。中间未配对的25bp序列,在高保真酶的作用下序列被补齐,从而构成完整的双链PLIN2基因的全长序列。在PCR仪上经过25个循环扩增,PLIN2基因得到扩增,PCR扩增程序见表3。表2PCR扩增反应体系表3PCR扩增反应条件1.3扩增片段的电泳检测以及回收PCR扩增后利用1.5%琼脂糖电泳30min,然后比照DNAmarker大小,在紫外灯下回收目的条带,然后利用胶回收试剂盒回收目的基因PLIN2条带。1.4载体与目的基因的酶切表4酶切体系将回收的PLIN2基因片段和pCDNA3.1-EGFP载体分别按上述表4准备反应体系,然后在37℃酶切1-2h;将酶切产物利用1.5%的琼脂糖电泳检测并利用胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段和载体片段。1.5载体与目的基因的连接:将酶切后的载体片段与PLIN2基因片段按如下体系配制反应体系表5,并放于16℃连接1h。表5连接体系1.6转化将要经T4连接酶连接后的产品加入到装有TOP10感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需要25ngDNA),体积应不超过感受态细胞的5%,轻轻旋转几次混匀内容物,冰浴30min。将离心管混合物放入加温至42℃的循环水中,热激90s,不要摇动管。快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。每管加入200μlSOC液体培养基,用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移到设置为37℃的摇床上,220rpm培养45min,使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。将适当体积(每个90mm平板达200μl)已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的LB培养基上。倒置平板,于37℃培养箱中培养12~16小时。1.7菌落PCR验证待平板上长出菌落,随机挑取若干个,进行菌落PCR验证,检测转化子,初步筛选含有目的基因的菌落(阳性克隆)。1.8测序验证,将阳性克隆送测序公司测序验证。1.9转染用质粒扩增与提取:利用无内毒素质粒提取试剂盒,提取质粒,含有PLIN2基因片段的质粒为PLIN2-pCDNA3.1-EGFP。1.10转染与筛选培育:采用脂质体转染技术将上述步骤1.9中获得的质粒载体PLIN2-pcDNA3.1-EGFP转染PK-15细胞系,并利用G418筛选。荧光显微镜下观察,当阳性细胞生长成克隆细胞团时,用微细玻璃针管将本文档来自技高网...
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【技术保护点】
猪PLIN2基因超表达的PK‑15细胞株,其特征是:PK‑15细胞含有人工转染的外源猪PLIN2基因,且PLIN2基因具有SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列,该细胞对PCV2病毒易感,且能产生效价达到10

【技术特征摘要】
1.猪PLIN2基因超表达的PK-15细胞株,其特征是:PK-15细胞含有人工转染的外源猪PLIN2基因,且PLIN2基因具有SEQIDNO:35所示的核苷酸序列,该细胞对PCV2病毒易感,且能产生效价达到10-7以上的病毒,该细胞是猪肾PK-15/PLIN2细胞株,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:C2017251。2.制备权利要求1中PK-15/PLIN2细胞株的方法,该方法包括如下步骤:1)PLIN2基因的克隆:根据PLIN2基因序列设计重叠PCR引物,共计34条,相邻引物之间有17bp反向互补重叠,中间有25bp未互补序列,34条引物拼接成PLIN2基因的全长,将34条引物混合后经过退火处理,相邻引物的17bp序列互补配对,中间未配对的25bp序列,在高保真酶的作用下序列被补齐,构成完整的双链PLIN2基因的全长序列,经过25个循环后,PLIN2基因得到扩增,然后将扩增获得的片段经电泳检测;2)利用胶回收试剂盒将扩增获得的PLN2基因片段回收,然后用将...

【专利技术属性】
技术研发人员:高其双刘明彭霞程百炼邓兵谭隽珺田晨雪濮振宇谭纤茹
申请(专利权)人:武汉市农业科学院武汉市工程科学技术研究院
类型:发明
国别省市:湖北,42

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