一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法技术

一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，利用Boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，从亚细胞结构出发，运用改良的Boyden小室法分离肝癌转移细胞胞体和突出，利用Western‑blot、RNA染色、免疫荧光等技术验证分离结果。可于研究在HCCLM3 肝癌细胞胞体与突出中差异表达的情况、筛选出与HCC浸润转移过程有关的微小RNA，为后续HCC肿瘤生物标记物的研究、相关临床诊疗提供新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法
本专利技术具体涉及分子生物
，具体涉及一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法。
技术介绍
肝癌是男性第五大常见癌症、女性第九大常见癌症，也是世界上癌症相关死亡的第二大原因。而肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）占到了肝癌中的75%。由于HCC起病隐匿，早期临床症状不明显，导致早期发现及诊断的难度较大，患者确诊时多属中晚期；而放化疗、肝移植等现行治疗手段对中晚期患者达不到应有疗效；且由于HCC的高侵袭转移能力，术后复发情况较普遍，患者的5年总体生存率仍然很低，从24%到41%不等。如何阐明HCC转移复发的机制从而进行针对性的治疗成为了目前临床上亟待解决的问题。HCC的发生和发展是一个典型的多阶段过程：首先是肝脏组织在外界刺激下（B型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染、黄曲霉毒素B1的摄入量或酒精滥用等）发生慢性肝炎或肝硬化，然后在经历一系列增生和不典型增生阶段后，最终获得肝内转移和远端转移的恶性表型。肿瘤的浸润转移是指肿瘤细胞脱离其原发部位，向其它部位传播，进而浸润正常组织，并经过淋巴道、血管或体腔及其它方式，转运到继发的靶组织或器官，从而继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程。细胞开始形成局部浸润和远处转移能力是恶性肝肿瘤早期特有的性质，因此研究肝肿瘤细胞浸润和转移初期机制对临床诊疗有十分重要的意义。而肝癌的进展涉及到很多调控细胞周期、细胞生长、细胞凋亡、细胞迁移的关键基因。Boyden小室，最初由Boyden用于对白细胞和巨噬细胞趋化性的分析，后经过改良用于肿瘤细胞运动性、侵袭性等的测定，用于不同的迁徙反应细胞。Boyden小室由上、下两个室组成，两室中间由带孔的滤膜分隔，亦可用鸡胚尿囊膜、人胚胎羊膜等分隔。待测细胞放在上室，其运动性通过测量滤膜上层到运动到最远的细胞之间的距离而确定；亦可计数在滤膜不同平面上细胞数、滤膜底部的细胞数或是另一张在下室的滤膜上细胞数。当上、下室中均为生理盐水时，细胞运动为随机运动。若上、下室中均加以同浓度的化学趋化剂或生长因子等，可以观察加强的细胞无定向运动。当两室中的化学驱化剂存在梯度时，该方法可以观察细胞定向运动。在一般情况下，细胞被放置在上部小室，允许迁移通过膜孔进入下室，其中趋化剂的存在。经过适当的培养时间，迁移到膜另一侧的细胞数量可计算。因此，Boyden小室通过细胞迁移实验也被称为过滤膜迁移实验、Trans-well迁移实验，或趋化试验。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的提供了一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，利用Boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，将进一步阐明肝癌细胞浸润转移的机制，可以为恶性肝细胞肿瘤预警、诊断、治疗和药物筛选提供新途径和新靶标。本专利技术采用的技术解决方案是：一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，所述的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法采用Boyden皿法分离突出和细胞体，具体步骤如下：（1）将六孔型1.0μm孔径的悬挂式细胞培养皿放入到浓度为10μg/mLI型胶原蛋白中37℃恒温静置2小时；（2）接着把孵有I型胶原蛋白的悬挂式细胞培养皿转移到不含I型胶原蛋白溶液的六孔板孔中，并置于4℃条件下过夜处理；（3）然后把肝癌细胞接种到孵有I型胶原蛋白的1.0μm孔径悬挂式细胞培养皿上，37℃静置24~30小时；（4）分离细胞突出：先用1×PBS洗涤，倒立悬挂式细胞培养皿，用移液枪吸去悬挂式细胞培养皿上侧的残留培养基，接着用浸有总RNA抽提试剂Trizol的细胞刮铲来搜刮悬挂式细胞培养皿上侧的细胞突出；（5）分离细胞体RNA：当分离细胞体中的RNA时，平放悬挂式细胞培养皿，用移液枪吸去悬挂式细胞培养皿里的培养基，然后用浸有总RNA抽提试剂Trizol的细胞刮铲来搜刮悬挂式细胞培养皿内侧的细胞体。所述的步骤（2）与步骤（3）之间还包括以下步骤：a、将肝癌细胞进行饥饿过夜处理，用0.5%胰酶EDTA溶液对贴壁的肝癌细胞进行消化分离，待显微镜下观察到细胞收缩变圆后，吸走胰酶，接着用含有10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基终止消化；b、经1500rpm离心10min，将肝癌细胞和培养基去除上清液后用无血清培养基重悬混匀。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，利用Boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，从亚细胞结构出发，运用改良的Boyden小室法分离肝癌转移细胞胞体和突出，利用Western-blot、RNA染色、免疫荧光等技术验证分离结果。可用于研究HCCLM3肝癌细胞胞体与突出中差异表达的情况、筛选出与HCC浸润转移过程有关的微小RNA，为后续HCC肿瘤生物标记物的研究、相关临床诊疗提供新的思路。附图说明图1为HCCLM3细胞株免疫荧光实验结果图。图2为HCCLM3细胞株EtBr染色实验结果图。图3为Boyden细胞培养皿结构示意图。图4为免疫荧光和免疫印迹法检验Boyden培养皿分离法有效性荧光图。图5为Ladder质检峰图。图6为HCCLM3肝癌转移细胞突出质检峰图。图7为HCCLM3肝癌转移细胞胞体质检峰图。具体实施方式现结合具体内容对本专利技术进行进一步说明，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术记载的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。材料和方法实验试剂与仪器细胞系：高转移肝癌细胞系HCCLM3为本实验室液氮中保存，最初均购于中国科学院上海细胞库。试剂（1）Dulbecco’smodifiedEagle’s培养基（DMEM）；（2）胎牛血清来自LifeTechnologies公司（美国）；（3）蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂来自罗氏生物公司（中国）；（4）细胞培养用胰酶细胞消化液、细胞培养用青霉素/链霉素溶液（100x）、DEPC水(DNase、RNasefree)(500ml)、免疫染色固定液、抗荧光淬灭封片液、1MTris-HCl，pH6.8、1.5MTris-HCl，pH8.8细胞培养用磷酸盐缓冲液（PBS）来自碧云天生物技术公司（上海）；（5）I型胶原蛋白来自SigmaAldrich公司（中国）；（6）Boyden悬挂式细胞培养皿（透明PET膜1.0um孔径）来自Millicell公司（美国）；（7）Anti-HistoneH3抗体、Tubulin抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、RNaseA来自碧云天生物技术公司（上海）；（8）血细胞计数板来自上海求精生化试剂仪器有限公司；（9）细胞刮刀来自美国Corning公司；（10）盖玻片来自江苏世泰实验器材有限公司；（11）表面带正电荷粘附载玻片来自江苏世泰实验器材有限公司。试剂配置（1）细胞培养液：以10%体积比将胎牛血清加入到DMEM或RPMI-1640培养基中，混合均匀，置4℃冰箱中保存；（2）10×本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，其特征在于，所述的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法采用Boyden 皿法分离突出和细胞体，具体步骤如下：（1）将六孔型 1.0μm 孔径的悬挂式细胞培养皿放入到浓度为 10μg/mL I型胶原蛋白中37℃恒温静置2小时；（2）接着把孵有 I 型胶原蛋白的悬挂式细胞培养皿转移到不含I型胶原蛋白溶液的六孔板空中，并置于4℃条件下过夜处理；（3）然后把肝癌细胞接种到孵有I型胶原蛋白的1.0μm 孔径悬挂式细胞培养皿上，37℃静置 24~30小时；（4）分离细胞突出：先用1×PBS 洗涤，倒立悬挂式细胞培养皿，用移液枪吸去悬挂式细胞培养皿上侧的残留培养基，接着用浸有总RNA抽提试剂Trizol的细胞刮铲来搜刮悬挂式细胞培养皿上侧的细胞突出；（5）分离细胞体 RNA：当分离细胞体中的RNA时，平放悬挂式细胞培养皿，用移液枪吸去悬挂式细胞培养皿里的培养基，然后用浸有总RNA抽提试剂Trizol的细胞刮铲来搜刮悬挂式细胞培养皿内侧的细胞体。

【技术特征摘要】
1.一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，其特征在于，所述的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法采用Boyden皿法分离突出和细胞体，具体步骤如下：（1）将六孔型1.0μm孔径的悬挂式细胞培养皿放入到浓度为10μg/mLI型胶原蛋白中37℃恒温静置2小时；（2）接着把孵有I型胶原蛋白的悬挂式细胞培养皿转移到不含I型胶原蛋白溶液的六孔板空中，并置于4℃条件下过夜处理；（3）然后把肝癌细胞接种到孵有I型胶原蛋白的1.0μm孔径悬挂式细胞培养皿上，37℃静置24~30小时；（4）分离细胞突出：先用1×PBS洗涤，倒立悬挂式细胞培养皿，用移液枪吸去悬挂式细胞培养皿上侧的残留培养基，接着用浸有总RNA抽提试剂Trizol的细胞刮铲来...

【专利技术属性】
技术研发人员：申志发，季敬璋，金玉，冯笑，胡雪梅，涂可欣，童庆超，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33