一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法技术

技术编号:17770132 阅读:34 留言:0更新日期:2018-04-21 22:56
一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,该方法主要结合了新兴的hiPSCs来源的3D脑组织和生物材料海藻酸钠丝,通过加以适度的酒精刺激,模拟妊娠期酗酒对胎儿早期脑发育的影响。该模型作为创新的体外器官发育疾病模型,不仅利于直观观察酒精对脑发育的形态学影响,也可以借鉴各种检测方法,研究酒精对脑发育影响的分子学和细胞学机制,弥补了传统细胞实验和动物实验的不足,为研究妊娠期酒精对胎儿早期脑发育的影响提供了有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法
本专利技术微流控芯片技术,具体涉及一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法。
技术介绍
研究病理条件的分子学和细胞学机制研究为我们更好地了解、控制和治疗疾病提供了基础。传统的生物方法主要包括2D的细胞培养方式和动物模型。2D的细胞培养无法模拟生理条件下细胞的微环境,包括三维细胞外基质、间隙流、细胞间相互作用等,因此与生理条件下相比细胞的形态功能有很大不足,不能完全反映病理条件下分子层面和细胞层面的异常变化。而动物实验目前主要是使用鼠、兔、果蝇、线虫等模式生物,虽然模式生物来源方便、培养条件简单,但是基于人与动物的极大不同,因此很难完全反映各种条件下人体的生理变化。而对于人体的研究在保证最低损伤和方便观察的前提下,较为常用的有核磁共振、CT等,但是这些方法不具实时监测特点,并且很多都无法应用于胎儿发育、近几年来各种干细胞来源的类器官发育得到了有效发展,包括神经干细胞、肠干细胞、胚胎干细胞以及iPSCs。类器官的特征是干细胞或原代细胞自发形成的3D细胞团结构,其含有相应组织器官的多种功能细胞,这些细胞自组装成具有一定结构功能特异性的组织,一定程度上模拟了相应组织器官的发育过程。其中体外hiPSCs来源的3D脑基本复制了胎儿早期脑发育的过程。但是目前来看类器官技术也有许多不足和需要改进的地方。由于其3D细胞团的结构特点,使得内部细胞由于缺少氧气和营养,出现大规模死亡,极大限制了体外类器官发育的程度,包括体积大小、功能成熟度等,而在生理情况下组织和器官中分散着血管组织来提供所需的氧气和营养。因此结合其他技术有望弥补这种不足。此外,现有的传统细胞培养技术培养类器官操作复杂、耗费时间长、可控性差。因此与现有的生物工程类手段结合有望优化类器官技术。丝状结构作为培养载体,有几大优势:首先,借助微流控芯片技术可根据实际应用灵活高效产生不同尺寸、厚度的海藻酸钠丝。其次,丝状结构具有较高的比表面积比,利于物质交换,对于细胞培养提供良好的生存环境。再次,丝状结构可导向细胞团的生长,产生结构类似的脑组织,并在发育过程中限制其生长,一定程度上模拟了生理情况下脑膜的作用。最后,海藻酸钠材料可在高盐或柠檬酸钠条件下溶解,释放细胞,满足不同的处理需求。但是目前将生物工程与hiPSCs来源的类器官相结合,建立人属的疾病模型领域尚属空白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,该方法使用海藻酸钠中空丝作为细胞培养载体,不仅保证了发育过程中的物质运输,同时实现可控的发育结构,并具实时监测的特点。本专利技术提供了一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其步骤主要分为四部分:(1)海藻酸钠中空丝的制备;(2)3D脑前期诱导;(3)3D脑包裹在海藻酸钠中空丝内;(4)酒精处理3D脑。步骤(1)海藻酸钠中空丝的制备,具体为:所述海藻酸钠中空丝的制备是利用套管形式的微流控芯片,制备的中空丝内径为600-1000μm,管壁厚度为50-200μm,所用液体无菌处理。所述海藻酸钠丝需浸泡在DMEM/F12培养基中,使其完成在培养基中的溶胀过程,并在4℃低温保存,便于后续操作。步骤(2)3D脑前期诱导,具体为:(1)使用带有坑状结构的PDMS芯片制备拟胚体:坑状结构的芯片置于24孔板内,小坑结构直径为600-800μm,深度为100-300μm,用于拟胚体的形成。(2)第1天,制备拟胚体,将2×105-6×105个hiPSCs消化成单细胞,并转移至(1)所述的芯片中,离心500-2000rpm,3-5min,所用培养基为KSR培养基,并加入5μMY27632;所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12,另外需添加占总体积20%的KnockOutReplacement(KSR),占总体积1%NEAA(NonEssentialAminoAcid,100×),占总体积1%GlutaMax(100×),占总体积1%penicillin-streptomycin(100×),以及0.1mMbeta-mercaptoethanol,4ng/mlbFGF。(3)第2天,将形成的拟胚体转移至低粘附的培养皿中,悬浮培养拟胚体,所用培养基为KSR培养基。(4)第5天,诱导拟胚体向神经上皮方向分化,将KSR培养基替换为神经诱导培养基;细胞团仍保持悬浮培养,每3天更换培养基。其中神经诱导培养基的基础成分为DMEM/F12,另外需添加占总体积1%N2(100×),占总体积1%GlutaMAX(100×),占总体积1%NEAA(NonEssentialAminoAcid,100×),1μg/mlheparin,占总体积1%penicillin-streptomycin(100×)。使用坑状结构的PDMS芯片制备拟胚体,其大小可通过小坑体积的变化以及细胞悬液中细胞的数量来调节,细胞球的大小范围约为50-500μm。HiPSCs使用Accutase进行适度消化,消化时间约为2-5min,确保最后消化成较小的细胞块。若消化过度成为散在的单个细胞,会使拟胚体结构中含有较多死细胞,影响后来的分化和发育;若消化不足,影响拟胚体的成球效果,较难形成大小一致的细胞团。HiPSCs使用Accutase消化成比较小的细胞块后,进行后续离心操作,使细胞尽可能的聚集在一起,利于形成体积比较大的拟胚体,有效提高后续脑发育的成功率。虽然拟胚体可在几个小时内形成,但是需要确保细胞24小时内在PDMS芯片内静置培养,确保拟胚体结构的稳定。步骤(3)3D脑包裹在海藻酸钠中空丝内,具体为:第10天,使用Matrigel重悬前期诱导的细胞团,并用注射器将细胞团注入海藻酸钠丝内,整个过程避免产生气泡,确保冰上操作维持低温,保证Matrigel不凝固。将含有细胞团的海藻酸钠丝置于37℃培养箱20-30min,使Matrigel凝固。将含有细胞团的海藻酸钠丝转移至6孔板中进行后续培养,所用培养基为神经分化培养基。所述神经分化培养基,所用培养基为神经分化培养基,其基础成分为体积比为1:1的DMEM/F12和Neuralbasalmedium,另外需添加占总体积1%B27(50×),占总体积0.5%N2(100×),占总体积0.5%NEAA(100×),占总体积1%GlutaMAX(100×),占总体积1%penicillin-streptomycin(100×),0.05mMbeta-mercaptoethanol。3D脑的发育过程需要使用Matrigel,Matrigel作为细胞外基质为3D脑发育提供三维介质,利于3D脑的快速发育。步骤(4)酒精处理3D脑具体步骤为:第11天,对照组使用神经分化培养基培养3D脑,样品组使用酒精浓度为20-200mM的神经分化培养基培养3D脑,所用的培养基需现用现配。此外样品组中6孔板间隙内需加入含同浓度酒精的PBS缓冲液,需使用封口膜密封,降低酒精挥发。由于酒精的挥发以及确保营养物质的供应,样品组和对照组都是每两天换一次培养基。本专利技术一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型,其后续检测方法如下:(1)显微镜明场下实时监测酒精处理情况下3D脑的生长速度和发育状态;(2)RT-PCR方本文档来自技高网
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一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法

【技术保护点】
一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于其主要步骤分为:(1)海藻酸钠中空丝的制备;(2)3D脑前期诱导;(3)3D脑包裹在海藻酸钠中空丝内;(4)酒精处理3D脑。

【技术特征摘要】
1.一种妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于其主要步骤分为:(1)海藻酸钠中空丝的制备;(2)3D脑前期诱导;(3)3D脑包裹在海藻酸钠中空丝内;(4)酒精处理3D脑。2.按照权利要求1所述妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于:步骤(1)海藻酸钠中空丝的制备,具体为:(1)利用套管形式的微流控芯片制备具有中空结构的海藻酸钠丝,内径为600-1000μm,管壁厚度为50-200μm,所用液体无菌处理;(2)制备的海藻酸钠丝需浸泡在DMEM/F12培养基中,使其完成在培养基中的溶胀过程,并在4℃低温保存,便于后续操作。3.按照权利要求2所述妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立方法,其特征在于海藻酸钠丝制备涉及到的仪器和溶液都必须无菌,实验前可进行相应的灭菌操作,具体为高温高压灭菌、UV照射或0.2μm孔径滤膜过滤。4.按照权利要求1所述妊娠期酒精暴露对胎儿脑损伤的体外模型建立,其特征在于:步骤(2)3D脑前期诱导,具体为:(1)使用带有坑状结构的PDMS芯片制备拟胚体:坑状结构的芯片置于24孔板内,小坑结构直径为600-800μm,深度为100-300μm,用于拟胚体的形成;(2)第1天,制备拟胚体,将2×105-6×105个hiPSCs消化成单细胞,并转移至(1)所述的芯片中,500-2000rpm离心3-5min,所用培养基为KSR培养基,并加入5μMY27632;(3)第2天,将形成的拟胚体转移至低粘附的培养...

【专利技术属性】
技术研发人员:秦建华朱玉娟于跃尹方超
申请(专利权)人:中国科学院大连化学物理研究所
类型:发明
国别省市:辽宁,21

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