一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基制造技术

本发明专利技术属于成肌细胞的分化培养，涉及一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，采用传代五次以上分离得到的小鼠成肌细胞为对象，通过细胞增殖培养、分化培养等步骤，优化生长培养基和分化培养基，传代五次以上的成肌细胞，85%以上的细胞可以分化肌管，可以有效的提高分离得到的原代成肌细胞的利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基
本专利技术属于成肌细胞的分化培养，涉及一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基。
技术介绍
C2C12是小鼠的成肌细胞，分化比较快，可形成具有收缩性的肌管，产生特征性的肌蛋白。因此，在各种医学研究中应用广泛，如生物医学、肌肉再生的临床研究等。成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复(再生)是非常重要的。培养中的成肌细胞可以表现出肌肉发生过程的特征，包括增殖，迁移，融合，肌管形成和收缩。生长于含有10％胎牛血清培养基中的肌肉细胞即使汇合了，也继续增殖；而当它们生长于含2-5％马血清的培养基中时，却发生融合并形成肌管。小鼠细胞系C2C12是广泛用来研究成肌细胞增殖和分化的细胞系。目前的科研要求研究者从实验动物中分离和培养原代的成肌细胞。在研究中发现，采用Rando描述的方法来分离和分化新生小鼠的成肌细胞非常困难，成功率低。随着实验步骤的增加，得到的成肌细胞越来越少，过程中丢失了很多成肌细胞和卫星细胞，卫星细胞是成肌细胞分化所必需的，并且是成肌细胞的来源；少数存活下来的成肌细胞生长及其缓慢，非常容易发生凋亡。申请公布号CN103881966A，专利技术名称：小鼠成肌细胞的制备方法及其应用，一种小鼠成肌细胞的制备方法，该方法包括下列步骤：A)将刚离体、并剪碎的小鼠腿部肌肉按体积比1：2加入分散剂，在37℃颠倒摇动5-10min，1000rpm离心5min，去上清，得组织碎片；B)组织碎片中按体积比1：2加入分散剂，在37℃上下颠倒摇动5-10min成浆糊状，按体积比1：10加入血清以终止酶消化；C)过滤80μm无菌尼龙网，去除大的组织碎片，滤液1000rpm离心5min，去上清，得沉淀；D)沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中，加原代成肌细胞生长培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养；E)当成肌细胞生长到40-80％丰度时，去生长培养基，加分化培养基，每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成。该方法能够分离到较多、较纯的小鼠成肌细胞和卫星细胞，从每克小鼠肌肉中能分离，到约1×108个细胞，其中成肌细胞和卫星细胞的比例达到90％以上。分离到的细胞生长旺盛，能够在马血清的诱导下分化形成大量典型的肌管，数量是其它方法形成肌管的10倍以上。但是该方法分离得到的成肌细胞为原代成肌细胞，分离小鼠骨骼肌成肌细胞并传代超过5次后，在2％马血清中将其诱导分化三天，只能形成少量的肌管。因此现有方法分离得到的原代成肌细胞传代4-5次以后，成肌细胞会丧失在体外形成肌管的能力，成肌细胞的增值和分化能力就会严重降低，采用上述方法分离的细胞没有办法长期传代保存利用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，采用优化生长培养基和分化培养基的方法，使得实验室分离得到的原代C2C12成肌细胞可以多次传代培养，并且其增殖分化能力没有明显降低。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，包括以下步骤：(1)取传代五次以上的C2C12成肌细胞接种于含有生长培养基的培养瓶中，置于CO2孵箱中培养，孵箱条件为占体积分数95％空气，5％CO2，温度为37℃，每48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；(2)当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用PBS将细胞洗涤2次，再加入1mL0.25％胰蛋白酶-EDTA，覆盖细胞，在倒置显微镜下可观察到细胞消化的情况，当细胞将要分离呈现圆形时，吸去胰酶终止消化，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入3mL生长培养基，用吸管轻轻吹打数次以打散细胞团块，吸出细胞悬液，放入10mL离心管中，1000r/min离心5min，吸掉上清液，加入适量新鲜生长培养基，用吸管吹打均匀后，按4000个/cm2铺于含有生长培养基的孔板内，置于CO2孵箱内，占体积分数95％空气，5％CO2，温度为37℃，每48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；(3)待细胞生长至80％汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基中诱导其进行肌向分化，每48h更换分化培养液，观察细胞形态使用倒置显微镜；所述的生长培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有10％胎牛血清，1％双抗，牛蒡子苷8-10μg/升，EGF0.2-0.3mg/L，胰岛素100-200mg/L，地黄多糖30-50mg/L；所述的分化培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有2％马血清，1％双抗，大豆苷原8-10μg/升，石榴提取物20-30mg/L，金银花提取物10-15mg/L。优选地：所述的生长培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有10％胎牛血清，1％双抗，牛蒡子苷8μg/升，EGF0.3mg/L，胰岛素160mg/L，地黄多糖35mg/L。优选地：所述的分化培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有2％马血清，1％双抗，大豆苷原10μg/升，石榴提取物30mg/L，金银花提取物13mg/L。优选地：所述的冻存传代为预冷冻保存的细胞为生长良好且存活率高，密度80％～90％，冷冻一日前更换新鲜的完全培养基,观察细胞的生长情形，依照细胞传代培养操作消化收集细胞,离心,去除上清液,加入完全培养基和DMSO(比例9:1),混合均匀,分装于冷冻保存管,1mL/vial,并取少量细胞悬浮液做污染检测，冷冻管置于4℃10min,-20℃30min,-80℃16～18h,最后放于液氮罐中长期保存。优选地：所述的牛蒡子苷的制备方法为：牛蒡子药材粉碎至40-50目，加8-10倍的水，回流提取两次，每次1-2h；合并滤液，滤液过滤，然后上D101树脂吸附洗脱，洗脱依次用2倍树脂体积的水、20％乙醇和50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，然后浓缩除去乙醇，浓缩后加入0.5％的活性炭煮沸30min，离心去除活性炭，0～4度静置过夜，过滤干燥，即得。优选地：所述的地黄多糖得制备方法为：熟地黄粉碎至40-50目的颗粒，石油醚脱脂，80％的乙醇脱单糖、低聚糖，药渣加热挥发完溶剂，然后按照料液比1g：60ml，纤维素酶3％，调节pH为4.0，充分搅拌，在40℃下酶解2小时，然后超声波提取：超声频率为40KW，提取时间3mi，离心分离，转速5000r/min，离心30分钟，取滤液,在滤液中加入85％乙醇溶液，并用碳酸氢铵调节pH为8.0，沉淀多糖，收集沉淀；对收集的沉淀进行减压蒸馏，得到地黄多糖。优选地：所述的石榴提取物的制备方法为：酸石榴表面洗净擦干，手工去皮、剥出籽粒，用手工榨汁机取汁，混匀后，用孔径0.1mm滤布过滤，4000r/min离心10min，收集上层石榴汁清液，调整滤液的pH为2.0，用AB-8树脂吸附，用70％的乙醇解吸，收集解吸液，浓缩干燥，既得石榴提取物。优选地：所述的金银花提取物的制备方法为：金银花粉碎至50-80目，然后按照料液比1g：10ml加入70％的乙醇回流提取两次，每次1h，合并滤液，减压浓度除去乙醇，将浓缩液的pH值调至1.8-2.2，以4倍量的乙酸乙酯分4次萃取，合并萃取液，用适量水洗涤1-2次以质量分数为50％的氢氧化钠溶液调pH值调为6-7，分离取水层，然后用D-101大孔树脂纯化，洗脱用70％乙醇，收集洗脱液，减压浓缩干燥，既得金银花提取物。本专利技术的有益效果：本专利技术的培养方法通过优化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，其特征在于：包括分化培养基和分化培养基，所述的生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷8‑10μg/升，EGF0.2‑0.3mg/L，胰岛素100‑200mg/L，地黄多糖30‑50mg/L；所述的分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有2%马血清，1%双抗，大豆苷原8‑10μg/升，石榴提取物20‑30mg/L，金银花提取物10‑15mg/L。

【技术特征摘要】
1.一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，其特征在于：包括分化培养基和分化培养基，所述的生长培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷8-10μg/升，EGF0.2-0.3mg/L，胰岛素100-200mg/L，地黄多糖30-50mg/L；所述的分化培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有2%马血清，1%双抗，大豆苷原8-10μg/升，石榴提取物20-30mg/L，金银花提取物10-15mg/L。2.根据权利要求1所述的一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，其特征在于：所述的生长培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷8μg/升，EGF0.3mg/L，胰岛素160mg/L，地黄多糖35mg/L。3.根据权利要求1所述的一种C2C12成肌细胞分化培养的培养基，其特征在于：所述的分化培养基为以高糖DMEM培养基为基液，含有2%马血清，1%双抗，大豆苷原10μg/升，石榴提取物30mg/L，金银花提取物13mg/L。4.根据权利要求1-3任一项所述的C2C12成肌细胞分化培养的培养基，其特征在于：所述的牛蒡子苷的制备方法为：牛蒡子药材粉碎至40-50目的颗粒，加8-10倍的水，回流提取两次，每次1-2h，合并滤液，滤液过滤，然后用D101树脂吸附洗脱，洗脱依次用2倍树脂体积的水、20%乙醇和50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，浓缩除去乙醇，浓缩后加入0.5%的活性炭煮沸30min，离心去除活性炭，0～4℃静置过夜，过滤干燥，即得。5.根据权利要求1-3任...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈旭，
申请(专利权)人：陈旭，
类型：发明
国别省市：河南,41