用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法技术

本发明专利技术提供一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法，培养基为含有1～85ng/mL NGF、1～100ng/mL bFGF、1～45ng/mL EGF、50～200pM胰岛素、1～20μg/mL粘连蛋白、10～100μg/mL VC的细胞基础培养基。本发明专利技术方法是通过培养基配方的优化(采用无血清配方培养基)诱导间充质干细胞转化为成纤维细胞并对其进行培养，在能够避免动物病原菌的污染的同时，够达到与含血清培养基培养相近甚至更高的成纤维细胞活力。

【技术实现步骤摘要】
用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法
本专利技术涉及干细胞分化
，涉及用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法。
技术介绍
成纤维细胞存在于皮肤真皮层，是皮肤创面愈合中的主要修复细胞，是构成肉芽组织的主要成分之一，可合成和分泌胶原纤维、连接蛋白、透明质酸等细胞外基质，也可通过分泌多种细胞因子参与创伤愈合，各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。在机体不发生损伤的前提下，如何获得更多地成纤维细胞，是人们广泛关注和亟待解决的问题。目前，现有技术多基于含血清培养基制备成纤维细胞，但是在使用过程中容易出现污染等问题，是获取大量的成纤维细胞的障碍。无血清培养基的出现虽在一定程度上能够避免污染，但是培养效果却不及于含血清培养基。
技术实现思路
基于此，提供一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，用该培养基获得的成纤维细胞活力高。一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，为含有1～85ng/mLNGF、1～100ng/mLbFGF、1～45ng/mLEGF、50～200pM胰岛素、1～20μg/mL粘连蛋白、10～100μg/mLVC的细胞基础培养基。在其中一些实施例中，所述用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基为含有50～60ng/mLNGF、20～30ng/mLbFGF、20～30ng/mLEGF、90～110pM胰岛素、8～12μg/mL粘连蛋白、40～50μg/mLVC的细胞基础培养基。在其中一些实施例中，所述用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基为含有55ng/mLNGF、25ng/mLbFGF、25ng/mLEGF、100pM胰岛素、10μg/mL粘连蛋白、45μg/mLVC的细胞基础培养基。在其中一些实施例中，所述的细胞基础培养基为DMEM基础培养基。本专利技术的目的还在于提供一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法。一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，包括如下步骤：获取间充质干细胞；将所述间充质干细胞加入上述诱导间充质干细胞向成纤维细胞转化的培养基中，诱导培养至间充质干细胞发生形变，获得成纤维细胞。在其中一些实施例中，所述间充质干细胞是由诱导多功能干细胞诱导、培养获得。在其中一些实施例中，所述诱导、培养所采用的培养基为：含有10～20％FBS、50～200ug/LbFGF、1～160pM胰岛素、1～10mML-谷氨酰胺、5～50ug/LSCF、2～5×10-8mol/L地塞米松的L-DMEM基础培养基。在其中一些实施例中，所述诱导、培养所采用的培养基为：含有10％FBS、150ug/LbFGF、80pM胰岛素、8mML-谷氨酰胺、35ug/LSCF、3.5×10-8mol/L地塞米松的L-DMEM基础培养基。在其中一些实施例中，所述的诱导多功能干细胞是将转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28共同导入尿细胞培养获得的。在其中一些实施例中，还包括采用采用上述的培养基对所述成纤维细胞进行增殖培养和/或传代培养。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术方法是通过培养基配方的优化(采用无血清配方培养基)诱导间充质干细胞转化为成纤维细胞并对其进行培养，在能够避免动物病原菌的污染的同时，够达到与含血清培养基培养相近甚至更高的成纤维细胞活力。进一步地，本专利技术还对培养基每个组分含量范围的优化，获得较优的培养基配方，用该配方的培养基培养成纤维细胞，能够增加传代代数。另外，本专利技术实施例方法采用的间充质干细胞是经诱导多能干细胞分化出的，有效回避了胚胎干细胞所面临的伦理学困扰，为干细胞的研究指明了方向，奠定了基础；同时，本专利技术实施例采用的诱导多能干细胞是经尿液细胞重编程获得的，取材方便，不会给人带来不必要的痛苦。附图说明图1为实施例1所得成纤维细胞的免疫荧光鉴定图；图2为实施例1所得成纤维细胞中Vimentin蛋白、CK15蛋白表达量结果图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法作进一步详细的说明。实施例1一、培养基的制备培养基A(IPS诱导培养基)：REGM(肾脏上皮细胞生长培养基)与MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)培养基按体积比1：1的比例混合；培养基B(间充质干细胞诱导培养基及维持培养基)：450mL低糖DMEM基础培养基、50mLFBS，150ug/LbFGF、80pM胰岛素、8mML-谷氨酰胺、35ug/LSCF、3.5×10-8mol/L地塞米松；培养基C(成纤维细胞培养基及维持培养基)：为含55ng/mLNGF、25ng/mLbFGF、25ng/mLEGF、100pM胰岛素、10μg/mL粘连蛋白、45μg/mLVC的H-DMEM基础培养基，500mL。二、尿液细胞的获取及培养1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗(市购)；2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作；3)每份尿液准备六孔板1个，将此孔用0.1wt％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体(即0.1wt％明胶)；4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，400g离心10min；5)吸去上清，每管留下约1～5mL，混合到一个离心管内；6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10～30mL，轻轻混匀；7)400g离心10min；8)吸去上清至留剩余0.5～1mL液体；9)把步骤8)所得液体加入步骤3)包被好的孔中，再加入含有Primocin的REGM培养基，每2mLREGM培养基中含有3μLPrimocin(原代细胞抗生素)；10)将六孔板放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理(即更换新鲜的培养基)。11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。三、Ips细胞(诱导多能干细胞)的诱导及培养1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28共同导入尿细胞，再将所得尿细胞分至预先用matrigel(基质胶)包被的六孔板中，用培养液A培养；2)转染后第2天，将培养液A更换为IPS培养基mTesR，培养过程中每天更换新鲜培养基，使克隆继续增殖；3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的十二孔板中，mTesR培养基培养获得诱导多能干细胞(ips细胞)。四、间充质干细胞的诱导及培养1)将制备好的ips细胞，用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至mTesR培养基于Matrigel包被好六孔板中进行培养；2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养基B进行诱导培养，每天更换培养液；3)培养5～7d细胞发生形变，获得间充质干细胞，培养基B继续培养。五、成纤维细胞的诱导及培养1)将制备好的间充质干细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至培养基B于六孔板中进行培养；2)待六孔板中的间充质干细胞融合度达到70％时，PBS清洗将培养基B清除干净，加入培养基C进行诱导培养，每天更换培养液；3)培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，为含有1～85ng/mL NGF、1～100ng/mL bFGF、1～45ng/mL EGF、50～200pM胰岛素、1～20μg/mL粘连蛋白、10～100μg/mL VC的细胞基础培养基。

【技术特征摘要】
1.一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，为含有1～85ng/mLNGF、1～100ng/mLbFGF、1～45ng/mLEGF、50～200pM胰岛素、1～20μg/mL粘连蛋白、10～100μg/mLVC的细胞基础培养基。2.根据权利要求1所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，为含有50～60ng/mLNGF、20～30ng/mLbFGF、20～30ng/mLEGF、90～110pM胰岛素、8～12μg/mL粘连蛋白、40～50μg/mLVC的细胞基础培养基。3.根据权利要求2所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，为含有55ng/mLNGF、25ng/mLbFGF、25ng/mLEGF、100pM胰岛素、10μg/mL粘连蛋白、45μg/mLVC的细胞基础培养基。4.根据权利要求1至3任一项所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，所述的细胞基础培养基为DMEM基础培养基。5.一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：获取间充质干细胞；将所述间充质干细胞加入权利要求1至4任一项所述的培养基中，诱导培养至间充质干细胞发生形变，获得成...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕飞，车七石，刘少辉，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44