一种细胞因子提取物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞因子提取物及其应用，所述细胞因子提取物按如下方法制备：将全血与抗凝剂充分混匀后，离心，取中间层加入生理盐水稀释，再加入红细胞裂解液和/或经血源性干细胞液，静置，离心，收集中间层，在37℃和‑80℃之间反复冻融，离心，取上清液，获得细胞因子提取物；或者将经血源性干细胞用生理盐水配制成细胞液，然后在37℃和‑80℃之间反复冻融，离心，取上清液，获得细胞因子提取物。本发明专利技术提供的细胞因子提取物能有效地在体外诱导干细胞增殖并成软骨分化，且制备方法简便、容易获取、有效安全，在软骨组织工程领域有极大的应用潜力，便于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞因子提取物及其应用(一)
本专利技术涉及一种成软骨体外分化方法，特别涉及一种细胞因子提取物及其在体外诱导经血源性干细胞增殖和成软骨分化中的应用。(二)
技术介绍
骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是临床最为常见的退行性骨关节病，以关节软骨退变为主要特征，伴发严重的关节疼痛、畸形、功能障碍等症状，影响人们正常生活(Lancet,2011.377(9783):2115–26)。随着老龄化社会的到来，OA发病率逐年上升，全球60岁以上老年人的OA发病率高达80％，患者总数约占全球人口的15％，是导致成人残疾的主要原因，严重威胁人类健康(AnnInternMed,2000.133(8):635-46)。然而，由于退变的关节软骨缺少自身修复能力，现有药物无法真正实现软骨修复，是骨科临床面临的一大难题(TissueEngPartBRev,2010.16(6):617-27)。间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)具有来源广泛、易于提取培养、低免疫源性、多向分化潜能、强大增殖能力、免疫调控及抗炎等特点，能在体外特定条件诱导下分化为软骨细胞，进而形成软骨组织，可针对软骨退变及软骨损伤进行有效干预，为OA的治疗开辟了一条新的途径(Circulation,2007.116(18):2053-61)。常用的MSCs是骨髓间充质干细胞，但其在分离过程具有一定的侵入创伤性而易造成患者不适。脐血干细胞也是MSCs的重要来源，但由于其获取依赖于母体妊娠而受到局限。其他的MSCs例如脂肪干细胞、羊水干细胞、脐带干细胞等，存在可获取性较低且再生能力差等问题(JObstetGynaecolRes,2012.38(5):804-9)。因此，亟需寻找一种无创且安全可靠的MSCs来源。2007年由Meng等从月经血中分离出了一种高度增生的MSCs，随后这类细胞被称为经血源性干细胞(JTranslMed,2007.5:57)。经血源性干细胞拥有多项其他干细胞无法企及的优点，包括取材容易、无侵袭性、低免疫原性、无成瘤性等，具有极大的临床应用潜力。目前尚无经血源性干细胞诱导成软骨分化的相关研究报道。此外，MSCs的临床应用面临许多共性问题：①MSCs在体外的活力和分化潜能较弱(ArthritisRheum,2002.46(3):704-13)；②MSCs体外培养过程中呈逐渐衰老趋势，增殖能力逐代减弱(TissueEng,2002.8(6):901-10)；③MSCs的体外增殖、分化、免疫等特性受培养条件、细胞密度、生长因子等多方面因素影响(StemCells,2006.24(2):462-71)。现有的MSCs诱导剂虽然能促进其成软骨分化，但需要添加激素和生长因子等成分，无法直接应用于临床。因此，除了来源问题，MSCs的临床应用还需解决生长和分化等方面的问题。本专利技术涉及一种从未公开过的促进经血源性干细胞增殖并成软骨分化的物质、制备方法及其应用，与现有的方法相比有较大区别：①该物质是自体源性的，能避免异源性物质存在的风险，能快速应用于临床；②该制备方法简便、易操作，不依赖于特殊仪器，适合推广。通过本专利技术处理的经血源性干细胞将使人工软骨彻底摆脱来源和生物活性等问题的限制，有望应用于组织工程软骨的构建研究和骨科疾病的临床治疗，是一种真正简便、经济、安全、有效而又容易大规模推广应用的方法。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种来源于人外周血及经血源性干细胞生物活性物质的富集方法，通过离心和反复冻融等方法获得含有高纯度的细胞生长因子及活性蛋白的生物活性物质，即细胞因子提取物，该物质能促进经血源性干细胞增殖活性，并诱导其成软骨分化，并且不存在异源性污染等风险，能为临床提供既安全又有效的干细胞促增值和成软骨分化的物质和制备方法，旨在解决临床软骨修复的问题：即缺少可应用的组织工程软骨构建方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种细胞因子提取物，所述细胞因子提取物按如下方法之一制备：(1)将全血与抗凝剂充分混匀后，第一次离心(150～1500×g离心6～20分钟，优选1200×g离心6分钟)，取中间白色絮状层加入生理盐水稀释(优选细胞浓度1×106～1×108个/ml)，再加入红细胞裂解液，混匀后静置30分钟，第二次离心(150～1500×g离心6～20分钟，优选1000×g离心6分钟)，收集中间白色絮状层，在37℃和-80℃之间反复冻融3-5次(即在-80℃冷冻，在37℃融化)，第三次离心(150～1500×g离心6～20分钟，优选1500×g离心10分钟)，取上清液，获得细胞因子提取物；(2)将经血源性干细胞用生理盐水配制成细胞液(优选1×106～1×108个/ml)，然后在37℃和-80℃之间反复冻融3-5次，离心(150～1500×g离心6～20分钟，优选1500×g离心10分钟)，取上清液，获得细胞因子提取物；(3)将全血与抗凝剂充分混匀后，第一次离心(150～1500×g速率离心6～20分钟，优选1200×g离心6分钟)，取中间白色絮状层加入生理盐水稀释，再加入红细胞裂解液，混匀后静置30分钟，第二次离心(150～1500×g速率离心6～20分钟，优选1000×g离心6分钟)，收集中间白色絮状层用生理盐水稀释成中间白色絮状层稀释液(细胞浓度1×106个/ml～1×108个/ml)，再将经血源性干细胞用生理盐水配制成1×106个/ml～1×108个/ml细胞液，然后将中间白色絮状层生理盐水稀释液与细胞液混合，在37℃和-80℃之间反复冻融3-5次，第三次离心(150～1500×g速率离心6～20分钟，优选1500×g离心10分钟)，取上清液，获得细胞因子提取物。进一步，所述方法(1)中抗凝剂为枸橼酸钠、肝素或水蛭素，优选为枸橼酸钠。所述抗凝剂可以用含抗凝剂的真空采血管的方式加入全血中，这是本领域技术人员公知的采血抗凝方法。进一步，所述方法(1)中抗凝血剂与全血体积比为1:9，优选抗凝剂为质量浓度3.2％～3.8％枸橼酸钠水溶液。进一步，所述方法(1)中红细胞裂解液为为氯化铵水溶液、淋巴细胞分离液或其他商品化或自行配制的红细胞裂解液，优选质量浓度1.0％氯化铵水溶液，氯化铵水溶液与所得样本的体积比优选为1:2，其余红细胞裂解液按照商品说明进行操作即可。进一步，所述方法(1)中第一次离心、第二次离心和第三次离心条件均为150～1500×g离心6～10分钟；更优选所述方法(1)中第一次离心条件为1200×g离心6分钟；第二次离心条件为1000×g离心6分钟；第三次离心条件为1500×g离心10分钟。对全血进行了第一次离心，目的是分离红细胞、白细胞及全血中其他活性物质如血小板等，通过去除上清液，取中间白色絮状层，可避免全血中大部分红细胞与白细胞。不同离心速率得到的样本量有所不同。加入红细胞裂解液的目的是去除剩余红细胞，通过第二次离心后，可去除剩余血浆和红细胞等碎片残留，进一步浓缩目标样本。根据需求配置不同的细胞浓度，进行反复冻融的目的是裂解全血中的活性细胞和经血源性干细胞，释放各类细胞因子，通过离心去除细胞碎片，最终得到细胞因子和活性蛋白混合物。本专利技术前期探索发现冻融3～5次所得到的细胞因子和蛋白含量最本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞因子提取物，其特征在于所述细胞因子提取物按如下方法之一制备：(1)将全血与抗凝剂充分混匀后，第一次离心，取中间白色絮状层加入生理盐水稀释，再加入红细胞裂解液，混匀后静置30分钟，第二次离心，收集中间白色絮状层，在37℃和‑80℃之间反复冻融，第三次离心，取上清液，获得细胞因子提取物；(2)将经血源性干细胞用生理盐水配制成细胞液，然后在37℃和‑80℃之间反复冻融，离心，取上清液，获得细胞因子提取物；(3)将全血与抗凝剂充分混匀后，第一次离心，取中间白色絮状层加入生理盐水稀释，再加入红细胞裂解液，混匀后静置30分钟，第二次离心，收集中间白色絮状层并用生理盐水稀释成中间白色絮状层稀释液，再将经血源性干细胞用生理盐水配制成细胞液，然后将中间白色絮状层稀释液与细胞液混合，在37℃和‑80℃之间反复冻融，第三次离心，取上清液，获得细胞因子提取物。

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子提取物，其特征在于所述细胞因子提取物按如下方法之一制备：(1)将全血与抗凝剂充分混匀后，第一次离心，取中间白色絮状层加入生理盐水稀释，再加入红细胞裂解液，混匀后静置30分钟，第二次离心，收集中间白色絮状层，在37℃和-80℃之间反复冻融，第三次离心，取上清液，获得细胞因子提取物；(2)将经血源性干细胞用生理盐水配制成细胞液，然后在37℃和-80℃之间反复冻融，离心，取上清液，获得细胞因子提取物；(3)将全血与抗凝剂充分混匀后，第一次离心，取中间白色絮状层加入生理盐水稀释，再加入红细胞裂解液，混匀后静置30分钟，第二次离心，收集中间白色絮状层并用生理盐水稀释成中间白色絮状层稀释液，再将经血源性干细胞用生理盐水配制成细胞液，然后将中间白色絮状层稀释液与细胞液混合，在37℃和-80℃之间反复冻融，第三次离心，取上清液，获得细胞因子提取物。2.如权利要求1所述细胞因子提取物，其特征在于所述方法(1)中抗凝剂为枸橼酸钠、肝素或水蛭素，所述抗凝血剂与全血体积比为1:9。3.如权利要求1所述细胞因子提取物，其特征在于所述方法(1)中红细胞裂解液为质量浓度1.0％氯化铵水溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：单乐天，戴玲华，郭永华，
申请(专利权)人：杭州易文赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33