诱导成纤维细胞分化汗腺细胞培养基及方法技术

本发明专利技术提供一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基及方法，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为12～55μg/mL的KGF、终浓度为5～70ng/mL的HGF、终浓度为1～10ng/mL的胰岛素、终浓度为1～20μg/mL的EGF、终浓度为18～55μg/mL的NGF、终浓度为1～7.5×10

【技术实现步骤摘要】
诱导成纤维细胞分化汗腺细胞培养基及方法
本专利技术涉及干细胞分化
，尤其涉及一种诱导成纤维细胞分化汗腺细胞培养基及方法。
技术介绍
皮肤是人体最大的器官，在抵御微生物入侵，紫外线辐射以及防止水分丢失、调节体温方面起重要作用，同时也是免疫系统的组成部分之一。皮肤创伤后的再生以及修复，主要是由邻近、健康的细胞分裂、增殖来实现的。但是大面积的烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损，特别是大面积烧伤，伤及皮肤全层及其附属器，仅靠创面自身难以实现皮肤的再生，因而需要足够的皮肤替代物进行修复。虽然目前有很多组织工程产品，但是存在的一个共同问题是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器，降低了皮肤对环境的适应能力，如何实现皮肤的功能重建成为当前创伤修复的研究热点。随着组织工程学的发展，目前研究表明，模拟汗腺的发生机制来诱导干细胞向汗腺细胞定向分化，可能是重建汗腺的唯一途径。汗腺的发生是一个非常复杂的过程，目前对其形态发生、生长调控及相关基因表达等机制尚未完全明确。而体外诱导干细胞向汗腺分化，能够模拟体内的这一过程，为汗腺重建提供理论基础。但是，传统的汗腺细胞制备方法中，需要采用汗腺细胞与干细胞进行共培养，不仅加大了研究的工作量，汗腺细胞有限的来源也限制了研究工作的快速发展。因此，有必要开发一种便捷高效的汗腺细胞的制备方法。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基。具体的技术方案如下：一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，为细胞基础培养基中添加有终浓度为12～55μg/mL的KGF、终浓度为5～70ng/mL的HGF、终浓度为1～10ng/mL的胰岛素、终浓度为1～20μg/mL的EGF、终浓度为18～55μg/mL的NGF、终浓度为1～7.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～5×10-4mol/L的腺嘌呤的。在其中一些实施例中，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为25～35μg/mL的KGF、终浓度为32～38ng/mL的HGF、终浓度为3～7ng/mL的胰岛素、终浓度为7～12μg/mL的EGF、终浓度为25～35μg/mL的NGF、终浓度为3.5～5.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～3×10-4mol/L的腺嘌呤的。在其中一些实施例中，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为28～32μg/mL的KGF、终浓度为32～35ng/mL的HGF、终浓度为4.5～5ng/mL的胰岛素、终浓度为9～11μg/mL的EGF、终浓度为28～31μg/mL的NGF、终浓度为4.8～5.3×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5～2.8×10-4mol/L的腺嘌呤的。在其中一些实施例中，该培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤的。在其中一些实施例中，所述细胞基础培养基为DMEM。本专利技术的另一目的是提供采用上述培养基诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法。一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的方法，包括如下步骤：获取成纤维细胞；向所述成纤维细胞加入上述的培养基，培养至出现多边形、铺路石样细胞，即获得汗腺细胞。在其中一些实施例中，所述的获取成纤维细胞，包括：从离体组织样本中分离出成纤维细胞单细胞的步骤、对所得单细胞进行增殖培养获得成纤维细胞的步骤。在其中一些实施例中，所述增殖培养采用的培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为20～100ng/mL的FGF、终浓度为1～50ng/mL的EGF、终浓度为1～10％的谷氨酰胺、终浓度为25～80ng/mL的胰岛素、终浓度为2～15ng/mL的HGF。在其中一些实施例中，所述增殖培养采用的培养基为细胞基础培养基中添加有终浓度为40～60ng/mL的FGF、终浓度为20～40ng/mL的EGF、终浓度为6～8％的谷氨酰胺、终浓度为40～55ng/mL的胰岛素、终浓度为10～15ng/mL的HGF。在其中一些实施例中，从离体组织样本中分离出成纤维细胞单细胞的步骤，包括：(1)取离体组织样本，无菌条件下，用含8～12％双抗的DMEM反复冲洗；(2)向步骤(1)冲洗过的离体组织样本中加入0.2～3％的胰酶，放于低温下过夜，次日分离表皮真皮；(3)用含8～12％双抗的DMEM反复冲洗步骤(2)所得表皮真皮；(4)将步骤(3)冲洗过的表皮真皮放于无菌生理盐水中并剪成小组织块，700～900g下离心3～7min，收集沉淀；(5)以所述沉淀3～4倍的体积加入0.2～3％的IV型胶原酶，充分消化；(6)所述消化后加入DMEM，混匀，过80～120μm的滤网，将所得滤液于280～320g下离心3～7min，所得沉淀即为成纤维细胞单细胞。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过采用上述特定成分和浓度的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，能够直接将单一种类的成纤维细胞诱导分化成汗腺细胞，快捷高效，克服了传统技术需将汗腺细胞与例如干细胞等进行共培养而导致汗腺细胞获得受限的缺陷。进一步地，本专利技术通过对培养基组分含量的优化，有益于汗腺细胞分化中均一生长、分化阶段一致，即能够使所得汗腺细胞的形态具有较好的一致性。另外，本申请还提供了特定配方的成纤维细胞增殖培养基，该培养基与诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基配套使用，能够很好的控制细胞的生长、定向分化和增殖，以便后续获得活力、形态均良好的汗腺细胞。本专利技术成纤维细胞的来源为人体离体组织样本，有效避免取血样、骨髓样等不必要的痛苦，同时避免伦理学顾虑，其具有长远的意义。附图说明图1为实施例1成纤维细胞流式检测表面标记物的表达情况测试结果图；图2为实施例1汗腺细胞流式检测表面标记物的表达情况测试结果图；图3为实施例1成纤维细胞免疫荧光检测情况测试结果图；图4为实施例1汗腺细胞免疫荧光检测情况测试结果图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基及方法作进一步详细的说明。实施例1一、培养基的制备：培养基A(成纤维细胞培养基)：细胞基础培养基为H-DMEM，添加有终浓度为55ng/mL的FGF、终浓度为25ng/mL的EGF、终浓度为5％(g/mL)的Glutamine(谷氨酰胺)、终浓度为45ng/mL的胰岛素、终浓度为10ng/mL的HGF，共计500mL。培养基B(汗腺细胞诱导培养基及维持培养基)：细胞基础培养基为DMEM，终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤，共计500mL。二、成纤维细胞的分离培养(1)取3～6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮，无菌条件下，用含10％(g/mL)双抗(100U/mL青霉素、100U/mL链霉素)的DMEM反复冲洗3次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为12～55μg/mL的KGF、终浓度为5～70ng/mL的HGF、终浓度为1～10ng/mL的胰岛素、终浓度为1～20μg/mL的EGF、终浓度为18～55μg/mL的NGF、终浓度为1～7.5×10

【技术特征摘要】
1.一种诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为12～55μg/mL的KGF、终浓度为5～70ng/mL的HGF、终浓度为1～10ng/mL的胰岛素、终浓度为1～20μg/mL的EGF、终浓度为18～55μg/mL的NGF、终浓度为1～7.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～5×10-4mol/L的腺嘌呤的。2.根据权利要求1所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为25～35μg/mL的KGF、终浓度为32～38ng/mL的HGF、终浓度为3～7ng/mL的胰岛素、终浓度为7～12μg/mL的EGF、终浓度为25～35μg/mL的NGF、终浓度为3.5～5.5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2～3×10-4mol/L的腺嘌呤的。3.根据权利要求2所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为28～32μg/mL的KGF、终浓度为32～35ng/mL的HGF、终浓度为4.5～5ng/mL的胰岛素、终浓度为9～11μg/mL的EGF、终浓度为28～31μg/mL的NGF、终浓度为4.8～5.3×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5～2.8×10-4mol/L的腺嘌呤的。4.根据权利要求3所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，为细胞基础培养基中添加有终浓度为30μg/mL的KGF、终浓度为35ng/mL的HGF、终浓度为5ng/mL的胰岛素、终浓度为10μg/mL的EGF、终浓度为30μg/mL的NGF、终浓度为5×10-7mol/L的三碘甲状腺原氨酸、终浓度为2.5×10-4mol/L的腺嘌呤的。5.根据权利要求1至4任一项所述的诱导成纤维细胞分化成汗腺细胞的培养基，其特征在于，所述细胞基础培养基为DMEM。6.一种诱导成纤维细...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄燕飞，车七石，刘少辉，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44