一种桔梗细胞的悬浮培养方法技术

本发明专利技术公开了一种桔梗细胞的悬浮培养方法，是取桔梗腋芽作为外植体，进行表面消毒；然后将消毒后的外植体置于愈伤组织诱导培养基上，进行培养获得愈伤组织；再进行细胞预培养、细胞悬浮培养和细胞继代培养，获得大量的悬浮培养细胞。本发明专利技术通过对桔梗进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的桔梗细胞培养物，为桔梗细胞悬浮培养生产次生代谢产物奠定了良好的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种桔梗细胞的悬浮培养方法(一)
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种桔梗细胞的悬浮培养方法。(二)
技术介绍
桔梗(Platycodongrandiflorus(Jacq.)A.DC.)是桔梗科桔梗属多年生草本植物。在我国南北都有栽培分布。桔梗既是重要的观赏花卉，同时更是一种重要的药用植物，桔梗的叶、花、根均可入药，尤其根具有重要医药价值,其细胞组织内含有多种皂甙，迄今已分得18种三萜皂甙。研究表明，桔梗皂甙不但具有镇静、镇痛及解热等中枢抑制作用,而且具有抗炎及镇咳祛痰、扩张血管、降压、降血糖作用、抗溃疡作用。目前桔梗主要采用种子繁殖，种子繁殖生长周期长，扦插繁殖又容易传播病毒，最重要的是受季节变化和耕地逐渐减少的影响，导致无法满足桔梗医药的市场需求。由于人工种植桔梗存在上述问题，因此迫切需要找到一种能安全、快速而大量生产桔梗细胞培养物的途径和方法。而采用组织培养技术不仅能解决桔梗品种的繁殖变异问题，还可以通过细胞培养大量生产桔梗次生代谢产物。桔梗的悬浮细胞系的建立目前还未见报道，在工业生产中，通过桔梗细胞培养是获得桔梗细胞次生代谢药物和提取药理活性因子的有效途径之一，而且可研究桔梗生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对桔梗的遗传育种具有特殊意义。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种桔梗细胞的悬浮培养方法。本专利技术采用的技术方案是：一种桔梗细胞的悬浮培养方法，所述方法按如下步骤进行：(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的桔梗腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)桔梗愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.2～1.5mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA0.1～1.0mg/L、2，4-D1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的桔梗单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA0.1～1.0mg/L、2，4-D1.0～3.0mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，即为鲜重；细胞增殖倍数＝(收获量鲜重—接种量鲜重)/接种量鲜重；细胞的生长速率(即每升培养液中每天生长量)＝(收获鲜重—接种量鲜重)/培养天数。上述(3)、(4)、(5)步骤中桔梗细胞的培养条件均为温度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为120r/min。进一步，步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基为添加6-BA1.0mg/L、2，4-D1.5mg/L的MS固体基本培养基。进一步，步骤(3)所述桔梗细胞的预培养液体培养基为添加6-BA0.5mg/L、2、4-D2.0mg/L的MS液体基本培养基，预培养时间为7天。进一步，步骤(4)所述桔梗细胞悬浮培养基为添加6-BA0.5mg/L、2，4-D2.0mg/L、酸水解酪蛋白0.6g/L的MS液体基本培养基,pH值为5.8、蔗糖30g/L。进一步，步骤(4)所述桔梗细胞悬浮培养基的细胞团接种量是30g/L。本专利技术所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖。所述大量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵NH4NO31.65克、硝酸钾(KNO3)1.9克、氯化钙(CaCl2·2H2O)0.44克、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.37克、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17克。所述微量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(KI)0.83毫克、硼酸(H3BO3)6.2毫克、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3毫克、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6毫克、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025毫克、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)37.3毫克，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素(VB1)0.1毫克，盐酸吡哆醇(VB6)0.5毫克，烟酸(VB5)0.5毫克。蔗糖浓度是20～40克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。其中MS固体培养基包含琼脂，MS液体培养基内不含有琼脂。本专利技术所述桔梗腋芽选自浙江杭州园艺场的长势良好、无病虫害的桔梗植株。本专利技术所述酸水解酪蛋白购自青岛海博生物公司。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：(1)本专利技术能够快速获得大量的桔梗悬浮培养细胞。(2)本专利技术通过在桔梗细胞悬浮培养前对其进行预培养、以及在桔梗悬浮培养基中加入酸水解酪蛋白，有效提高了桔梗细胞生长速度，增加了细胞鲜重，实现了工厂化大规模生产桔梗细胞。(3)本专利技术获得的桔梗愈伤组织具有较高诱导率、生长旺盛、不褐化等优点，可长期继代保持，通过桔梗愈伤组织进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的桔梗细胞培养物，从而可有效解决当前桔梗植物资源和药材资源短缺的问题。(四)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的桔梗腋芽作为外植体，用自来水冲洗30min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8min，再用无菌水冲洗3遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)桔梗愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23℃下，暗培养10天，然后每天光照8小时、光照强度为1000lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.2mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桔梗细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的桔梗腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净，在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)桔梗愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6‑BA(即6‑苄氨基腺嘌呤)0.2～1.5mg/L、2，4‑D(即2,4‑二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6‑BA 0.1～1.0mg/L、2，4‑D1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的桔梗单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6‑BA 0.1～1.0mg/L、2，4‑D 1.0～3.0mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；上述(3)、(4)、(5)步骤中桔梗细胞的培养条件均为温度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为120r/min。...

【技术特征摘要】
1.一种桔梗细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的桔梗腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净，在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)桔梗愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.2～1.5mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA0.1～1.0mg/L、2，4-D1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的桔梗单个细...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，谢丹，
申请(专利权)人：杭州纽贝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33