吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧成中的应用，属于蛭弧菌技术领域。本发明专利技术利用吲哚或吲哚与钙镁离子，促进了蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN‑1蛭质体的形成；确认了其具有明显延长蛭弧菌微生物制剂保质期的效果；且可在长时间内有效保持蛭弧菌微生物制剂中菌体的活力。本发明专利技术提供的高密度蛭质体可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，具有广裂解谱性质，且其裂解作用同蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDN‑1混合体(既含有蛭质体又含有游泳体)相比较优。本发明专利技术提供的促蛭质体培养方法简单可行，适用于推广使用，有望为水产养殖业防治病害作出贡献。

【技术实现步骤摘要】
吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用
本专利技术属于蛭弧菌
，特别涉及一种吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。
技术介绍
弧菌(vibrios)是海洋环境中最为常见的细菌类群之一，广泛存在于海水、海底沉积物及鱼、虾、贝、蟹、海参、海带等等海产品中。《伯杰氏细菌学手册》第8版记载了35种弧菌，它们中相当一部分是水产养殖生物的重要致病菌。在水产业界，由副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌等各种弧菌引发的养殖生物的疾病统称为弧菌病(vibriosis)，它每年给水产业界造成巨大的经济损失。目前，在水产养殖中，针对病害，仍普遍使用抗生素和化学药物，导致耐药菌株产生及药残超标，引发多宝鱼药残事件等食品安全问题。而蛭弧菌(Bdellovibrio-and-likeorganisms，BALOs)为一类极其好氧的寄生性革兰氏阴性菌，具寄生、进而裂解其它细菌的作用。众多研究表明，蛭弧菌具有裂解水产动物养殖中常见致病菌如溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibriocholera)等的能力，通过抑制这些有害菌群的滋生和转移，能够保持甚至增加水产动物肠道中本就对致病弧菌有抑制作用的益生菌如乳酸菌和双歧杆菌等的数量，激发水产动物肠道免疫系统运作，增强机体免疫力、抗病力和抗应激能力，从而改善水产动物肠道菌群结构、提高其存活率。蛭弧菌广泛存在于自然环境如海洋等，也存在于鱼、虾、牛、马、猪、鸭和人等肠道，为它们各自微生物群落固有一员，但不具侵染植物、鱼、虾及人等哺乳动物细胞能力。此外，它在健康人肠道中数量众多，维持着肠道微生态系平衡；在患肠炎等病人中则严重减少乃至消失。它在调控人肠道各微生物类群、维持生态平衡的有益作用。因此，蛭弧菌因可裂解致病性弧菌而在海水养殖中倍受重视，目前已成为养殖中有益菌之一。虽然正在被越来越广泛的使用，但目前市面上的产品几乎不存在有活性的蛭弧菌，或数量极少。我们通过研究蛭弧菌发现，其生活史包括带鞭毛营运动但不增殖的游泳体阶段(freeswimmingphase)和在宿主细胞内行生长繁殖的蛭质体阶段(Bdelloplastphase)，且蛭弧菌完成一个生命周期仅需4个小时。在游泳体阶段，蛭弧菌需消耗巨大能量和氧营运动生活，以便遇获宿主。如在一段时间内未遇宿主，则能量和/或氧耗尽而死去。此阶段一般不超过数小时。换句话说，游泳体蛭弧菌极易死亡，极难存活。在蛭质体阶段，蛭弧菌已进入到宿主胞质空间，在宿主细胞壁保护下，脱去了鞭毛，通过分解宿主细胞营养自身，成长杆状。之后，通过多分裂，分成多个小段，每小段长出鞭毛，即成子一代游泳体。已有研究表明，蛭质体阶段，生长(变长的过程)可被随时打断。待环境条件合适后，蛭质体再行分裂、分化成多个游泳体。因此，相比脆弱且高耗氧的游泳体，低耗氧的蛭质体耐受恶劣环境能力强。且蛭质体和游泳体具同等作用力。因此解决当前蛭弧菌产品所存在的活菌存活率低、保质期短的问题的关键在于在高浓度发酵过程中转变游泳体为蛭质体，同时延缓蛭质体发育。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。通过添加吲哚或吲哚与钙镁离子来促进海洋蛭弧菌蛭质体形成，提高其浓度的方法。该方法弥补了实验技术中蛭弧菌微生物制剂保质期较短的缺点。本专利技术的另一目的在于提供一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用，尤其是吲哚或吲哚与钙镁离子在延长海洋蛭弧菌蛭质体的保质期中的应用。优选的，所述的吲哚的使用终浓度为1～3mM；更优选为2～3mM，最优选为3mM。优选的，所述的钙镁离子的摩尔比为2：1。优选的，所述的吲哚与钙镁离子的使用终浓度分别为1～3mM、(4～40)/(2～20)mM；更优选为2～3mM、(4～20)/(2～10)mM；最优选为3mM、20/10mM。一种海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂，通过以下方法制备得到：在含有宿主菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌，于25～35℃、150～300rpm培养36～48h，再次添加宿主菌，并加入吲哚或吲哚与钙镁离子，继续培养20～28h，培养液经4℃、6000～8000rpm离心10～15min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清液，沉淀使用质量体积比(g/mL)10～25‰(优选为15‰)盐度的灭菌蒸馏水吸打悬浮，调整其浓度至1012PFU/mL，即是海洋蛭弧菌蛭质体微生物制剂。优选的，所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDN-1。所述的蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDN-1，是来源于福建某水产养殖的海水中，经人工富集培养、分离纯化得到，是一株以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为寄生宿主的蛭弧菌。所述的蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDN-1的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2017年11月27日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCCNO：60291。所述的蛭弧菌BDN-1的培养温度优选为选为25～35℃(更优选为30℃)，pH优选为6.5～8.0(更优选为7.2)，盐度优选为10～25‰(更优选为15‰)。培养所述的蛭弧菌BDN-1的培养基优选为DNB培养基；所述的蛭弧菌BDN-1，具有如下形态特征和生理生化特性：a、所筛选的蛭弧菌BDN-1革兰氏染色为阴性，椭圆形，无芽孢，端生单根鞭毛；b、噬菌斑的形态特征为：所述的蛭弧菌BDN-1在DNB双层固体培养基平板30℃培养3天后，噬菌斑呈圆形，透明，湿润，边缘整齐，直径2～3mm；本专利技术的机理是：本专利技术就现有研究，专利技术一种通过在高浓度发酵过程中添加各种钙镁离子以及吲哚组合来促进蛭质体的转变，并延缓其发育，再将其浓缩后冷冻干燥或直接保藏，来延长蛭弧菌蛭质体试剂的保质期，保证其存活率的同时，投入市场应用，有望为水产养殖业防治病害作出贡献。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术利用钙镁离子组合以及其与吲哚的组合，促进了蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDN-1蛭质体的形成；确认了其具有明显延长蛭弧菌微生物制剂保质期的效果；且可在长时间内有效保持蛭弧菌微生物制剂中菌体的活力。本专利技术提供的促蛭质体培养方法简单可行，适用于推广使用。(2)本专利技术提供的高密度蛭质体可抑制会引发水产养殖生物病害的弧菌，具有广裂解谱性质，且其裂解作用同蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDN-1混合体(既含有蛭质体又含有游泳体)相比较优；(3)本专利技术提供的蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDN-1高密度蛭质体组同对照组相比保质期得到了延长。附图说明图1是蛭弧菌BDN-1的DNB双层固体培养基平板法分离结果图。图2是蛭弧菌BDN-1的透射电镜观察结果图。图3是实施例2中的不同浓度吲哚组的蛭弧菌BDN-1蛭质体密度结果图。图4是实施例3中的不同浓度钙离子组的蛭弧菌BDN-1蛭质体密度结果图。图5是实施例4中本文档来自技高网...

【技术保护点】
吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。

【技术特征摘要】
1.吲哚或吲哚与钙镁离子在促进海洋蛭弧菌蛭质体形成中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：吲哚或吲哚与钙镁离子在延长海洋蛭弧菌蛭质体的保质期中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的吲哚的使用终浓度为1～3mM。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的吲哚的使用终浓度为2～3mM。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的钙镁离子的摩尔比为2：1。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的吲哚与钙镁离子的使用终浓度分别为1～3mM、(4～40)/(2～20)mM。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的吲哚与钙镁离子的使用终浓度分别为2～3mM、(4～20)/(2～10)mM。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的吲哚与钙镁离子的使用终浓度分别为3mM、20...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡俊鹏，陈丹，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44