一株产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株SX3411制造技术

本发明专利技术属于饲料添加剂领域，具体涉及从一个养猪场附近分离到一株产抗菌肽的枯草芽孢杆菌（

【技术实现步骤摘要】
一株产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株SX3411
本专利技术涉及饲料添加剂——微生物制剂领域，具体涉及一种产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株SX3411。
技术介绍
2013年中华人民共和国农业部第2045号公告饲料添加剂品种目录中规定了34个菌种可用作动物微生物饲料及饲料添加剂，其中就包含了枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌正常情况下对高温的耐受程度比其他类的细菌强很多，因此非常适合于高温制粒饲料应用；枯草芽孢杆菌可产生和分泌多种对动物肠道有益的物质，包括消化酶类、B族维生素和多种抑菌物质。此外，枯草芽孢杆菌刺激动物肠道，激活免疫系统，提高对疾病的抵抗能力。有资料表明枯草芽孢杆菌可以耐唾液和胆汁的攻击，有较好的耐酸碱特性，在酸性胃环境中能保持活性，是微生物中可直达大小肠的活菌。抗菌肽通常由12～100个氨基酸残基组成，多含疏水性氨基酸，多数是两亲性阳离子肽。天然抗菌肽抗菌谱广，具有热稳定性和较好的水溶性，对高等动物正常细胞几乎无毒害作用，且不易产生耐药性。对不同物种抗菌肽的研究已成为热点，抗菌肽有可能作为新一代的抗菌药物替代传统抗生素。来源于细菌的抗菌肽也被称为细菌素（bacteriocin）。细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，通常细菌素都是一些阳离子肽，具有疏水性或两亲性。细菌素根据它们的生物化学性质分为4类：Ⅰ类细菌素，被称为硫醚抗生素，分子质量小于5kDa，由19～38个氨基酸组成，具有黏膜活性和耐热性，其分子含有罕见的硫醚氨基酸，如羊毛硫氨酸（lanthionine）和β－甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)。II类细菌素的分子质量比较小(4～6kDa)，具有热稳定性，又能被分成三群：（1）IIa类（bacteriocinIIa）为李斯特菌活性多肽（Listeria-activepeptides），在N端带共同序列-Y-G-N-G-V-X-C-；（2）IIb类（bacteriocinIIb）为二肽细菌素（two-peptidebacteriocins），其抗菌活性要求两个成份；（3）IIc类（bacteriocinIIc）为巯基活性肽，活性要求有还原性半胱氨酸残基。Ⅲ类细菌素分子质量大于30kDa，为热不稳定蛋白质。IV类细菌素是复合多肽，活性要求包含有脂类或碳水化合物基团。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株SX3411，它能在高温和pH2-11条件下有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，改善动物肠道健康。为解决上述技术问题，采取的技术方案如下：本专利技术提供的产抗菌肽菌株具体为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）SX3411，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCCNO.14396。所述枯草芽孢杆菌菌株（Bacillussubtilis）SX3411的菌落形态为：菌落表面粗糙不规则且边缘不整齐，菌落不透明，呈现灰白色或略显黄色。所述枯草芽孢杆菌菌株SX3411筛选自江西省南昌市麻丘镇一养猪场附近，可产抗菌肽，具有抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的特性。所述枯草芽孢杆菌菌株SX3411经过发酵培养以后，其发酵液经过超滤管超滤以后，所获得的保留液有很好的抑菌活性，而超滤以后的的滤液很少有抑菌活性。这表明其抑菌物质不是小分子物质，而主要是多肽类物质。所述枯草芽孢杆菌菌株SX3411，在非连续培养的条件下，在培养的18-20小时开始产生抗菌肽，其发酵液具有抑菌活性。所述枯草芽孢杆菌菌株SX3411所产生的抗菌肽可以在pH2-11的范围内均有较好的抑菌活性,表明枯草芽孢杆菌菌株SX3411所产生抗菌肽有较好的适应酸碱的特性,适合在肠道内起抑菌作用。所述枯草芽孢杆菌菌株SX3411所产生的抗菌肽有较好的适应高温的特性，可以在80℃高温下仍有抑菌活性。有益效果：本专利技术提供的枯草芽孢杆菌菌株SX3411所具有的特性非常适合用于动物肠道健康的改善。其活菌具有抵抗高温，适于饲料的加工；其所产抗菌肽的抑菌活性可以在温度达到80℃高温时仍有活性，适于工业化的生产加工；其所产抗菌肽具有较好的酸碱适应范围，可在强酸的情况下仍有活性，适于在肠道中发挥功能，显著提高营养物质在肠道中的消化吸收。附图说明图1.菌株SX341116SrDNA序列的系统进化树分析结果图2.SX3411菌株发酵液经过超滤以后的抑菌试验（注：滤纸片直径8mm）图3.SX3411菌株发酵液经过超滤以后保留液的SDS-PAGE分析图4.SX3411菌株发酵液的抑菌活性（注：滤纸片直径8mm）图5.pH值对菌株SX3411发酵液中抑菌物质抑菌活性的影响（注：滤纸片直径8mm）图6.pH值对菌株SX3411发酵液中抑菌物质抑菌活性的影响（注：滤纸片直径8mm）。具体实施方式实施例1菌株的筛选和鉴定：步骤1.样品采集于江西省南昌市麻丘镇的数个家庭养猪场周边的排粪沟附近，采集点包括猪粪、附近土壤和水体，以10mL的离心管收集每个样品，每次采集30～50个样品，分三次采集。步骤2.样品收集结束后，在每个装样品的离心管中加入无菌水悬浮样品，随即在100℃沸水中处理样品10min，处理结束后每个样品取100uL涂布于LB固体培养基上，37℃培养24h，收集可能的芽孢杆菌菌落，是为粗筛。步骤3.粗筛的菌落分别接种在带有0.5mLLB液体培养基的1.5mL的离心管中，37℃培养24～30h，而后离心收集上清液，滤纸法用固定大小的滤纸片蘸取上清液，以金黄色葡萄球菌为抑菌对象，筛选有抑菌活性的菌株，获得一株具抑菌活性的菌株SX3411。步骤4.菌种的鉴定采用16SrDNA测序的方法。经PCR扩增后，获得的16SrDNA序列并上传GenBank数据库，其序列号（AccessionNo）为KY848340.1，在NCBI中进行BLAST比对（见图1），确定菌种为枯草芽孢杆菌，即BacillussubtilisSX3411。实施例2超滤法粗分离发酵液中的抗菌肽步骤1.将购买于美国Millipore公司的3kD的超滤离心管置于0.2mo1/LNaOH溶液中，浸泡30min以上，取出，浸泡于20%酒精中保存。步骤2无菌双蒸水清洗超滤管后，取500μL发酵上清液于3KD超滤管中，5,000-10,000r/min离心，中间的离心速度逐步增大，最终超滤管内保留液体积约为40μL，收集保留液和滤液。步骤3.各取20μL的保留液与滤液进行滤纸片扩散法做抑菌活性实验（滤纸片直径8mm）。以金黄色葡萄球菌为目标菌，结果表明仅有保留液存在较好的抑菌活性，而滤液无抑菌活性（见图2）。这表明小分子的物质无抑菌活性，起抑菌活性的主要是多肽类物质。步骤4.将超滤离心以后的保留液进行SDS-PAGE电泳分析，初步判断抗菌物质为抗菌肽，其分子量比较小，约5kDa大小（见图3）。实施例3SX3411菌株发酵液抑菌物质对细菌的抑菌活性步骤1.SX3411菌株的活化-70℃保存的SX3411菌种取出用新鲜LB液体培养基稀释，用接种环接种至LB固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h。挑取单菌落至新鲜LB培养基，37℃于摇床200rpm/min进行扩大培养。步骤2.指示菌株的活化用到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为枯草芽孢杆菌为

【技术特征摘要】
1.一株产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为枯草芽孢杆菌为BacillussubtilisSX3411，菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCCNO.14396。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：付鸣佳，肖世平，叶德晓，钟雪晴，杨志海，
申请(专利权)人：江西天佳生物工程股份有限公司，江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36