一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用技术

本发明专利技术涉及微生物生物技术领域，具体为一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用。主要技术方案如下：该菌株的名称为S288C‑YOL032W，菌株的保藏编号为CGMCC No.13926，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年03月24日；该菌株携带有YOL032W基因，该基因GenBank登录号为NM_001183286.1。该酿酒酵母菌株为单细胞真菌，一般呈卵圆形、圆形。菌落形态与细菌相似，但较大较厚，呈乳白色，表面湿润、粘稠。营养方式为异养兼性厌氧型。在培养基中生长时为游离态，乳白色。本发明专利技术的重组酿酒酵母S288C‑YOL032W能在分别含有高浓度乙酸、糠醛和香草醛环境胁迫条件下具有良好的生长和较高的乙醇发酵性能。

【技术实现步骤摘要】
一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用
本专利技术属于微生物生物
，特别涉及一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用。
技术介绍
燃料乙醇作为一种清洁的可再生能源是重要的石油替代品，具有良好的发展前景。以来源丰富且廉价的纤维素生物质农林废弃物为原料生产燃料乙醇，是国内外生物能源发展的重要方向。但是，木质纤维素原料在预处理过程中可产生对细胞生长和代谢具有毒性的副产物，包括弱酸类、醛类和酚类等(Omics：aJournalofIntegrativeBiology，2011，15：647-653)。这些副产物通过抑制酵母菌有氧呼吸、增加细胞膜透性、破坏胞内酶活性等途径抑制微生物菌体生长和乙醇发酵(JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology，2004，31：345-352)，导致较低的纤维素乙醇生成效率。YOL032W是磷脂合成蛋白基因，在胆碱存在时该基因的表达明显被抑制，表明YOL032W与磷脂酰胆合成相关(Genetics，2006，173：621-634)。有研究者将单倍体酿酒酵母BY4741的YOL032W基因敲除后其在含山梨酸平板上的生长状态明显下降，表明该基因与弱酸耐性相关(MolecularBiologyoftheCell，2004，15：706-720)。而该基因过表达与乙酸、糠醛和香草醛耐受性关系尚有待研究。
技术实现思路
为弥补现有技术的不足，本专利技术提供一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母及制备方法、应用，能在分别含有高浓度乙酸、糠醛和香草醛等环境胁迫条件下良好生长和具有较高的乙醇发酵性能。本专利技术的技术方案如下：一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母S288C-YOL032W(SaccharomycesCerevisiae)及制备方法、应用，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.13926，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年03月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌株携带有YOL032W基因，该基因GenBank登录号为NM_001183286.1。该酿酒酵母菌株为单细胞真菌，一般呈卵圆形、圆形。菌落形态与细菌相似，但较大较厚，呈乳白色，表面湿润、粘稠。营养方式为异养兼性厌氧型。在培养基中生长时为游离态，乳白色。PGK1启动子序列GenBank登录号为FJ415226.1，CYC1终止子序列GenBank登录号为EF210198.1。通过基因工程手段在酵母的pHO整合载体(NCBI：#AF324728，美国utah大学DavidJ.Stillman惠赠；Nucleicacidsresearch，2001，29：e59)的基础上连接PGK1强启动子和CYC1终止子构成pHO组成型表达载体。然后把PCR扩增获得的YOL032W基因连接在PGK1启动子和CYC1终止子之间，线性化后电转导入酿酒酵母S288C中，进行过表达。导入的目的片段在酿酒酵母基因组的HO基因位点(Yeast，1997，13：1563-1573)进行整合表达。本专利技术采用酿酒酵母的pHO组成型表达载体进行重组菌株的整合表达，pHO组成型表达载体可以通过同源重组的方式在酿酒酵母的HO基因位点进行整合表达，该载体通过基因工程手段在质粒的多克隆位点插入PGK1启动子和CYC1终止子，获得组成型整合表达，根据遗传霉素G418抗性进行筛选。自絮凝酵母SPSC01具有絮凝能力好、絮凝性状稳定及乙醇发酵性能优良等特点，已在燃料乙醇生产中得到应用。酵母细胞絮凝后，对包括乙醇抑制在内的诸多环境胁迫的耐受性得到提高(JournalofBiotechnology，2007，131：270-275)。鉴于絮凝酵母SPSC01在乙醇发酵中的诸多优点，且与模式菌株S288C相比，其基因组有大量突变。因此，本专利技术中以絮凝酵母SPSC01为模板获取YOL032W基因，在酿酒酵母S288C中进行过表达，获得重组酿酒酵母菌株S288C-YOL032W。目前的研究大多只关注菌株对一种或者一类抑制物的耐性的提高，而本专利技术中重组酵母菌株S288C-YOL032W分别对木质纤维素预处理过程中产生的多种抑制物的耐性均有提高，如乙酸、糠醛和香草醛。在高浓度抑制物添加下S288C-YOL032W与对照菌株S288C-HO相比，不仅生长状态良好且乙醇发酵性能提高。本专利技术同时请求保护所述的重组酿酒酵母菌S288C-YOL032W在抑制物胁迫条件下的应用，比如在高浓度乙酸、糠醛和香草醛的条件下生长良好，并且有较高的乙醇发酵效率。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术提供了一种新型菌株；(2)本专利技术的重组酿酒酵母S288C-YOL032W能在分别含有高浓度乙酸、糠醛和香草醛环境胁迫条件下良好生长和具有较高的乙醇发酵效率。附图说明图1YOL032W基因片段的PCR扩增。图2pHO-YOL032W载体。图3阳性转化子PCR鉴定。图4重组空载酵母S288C-HO对照菌株和重组酿酒酵母S288C-YOL032W在含有不同胁迫抑制物平板中生长比较；其中：(a)不添加抑制物情况下过表达菌株和对照菌株生长情况；(b)乙酸10g/L添加下过表达菌株和对照菌株生长情况；(c)香草醛1g/L添加下过表达菌株和对照菌株生长情况；(d)糠醛1.5g/L添加下过表达菌株和对照菌株生长情况。图5重组空载酵母S288C-HO对照菌株和重组酿酒酵母S288C-YOL032W在10g/L乙酸添加下乙醇发酵情况；其中：(a)乙酸10g/L添加下过表达菌株和对照菌株生长随时间变化情况；(b)乙酸10g/L添加下发酵液中乙醇浓度随时间的变化情况；(c)乙酸10g/L添加下发酵液中残余葡萄糖随时间变化情况。图6重组空载酵母S288C-HO对照菌株和重组酿酒酵母S288C-YOL032W在2g/L香草醛添加下乙醇发酵情况；其中：(a)2g/L香草醛添加下过表达菌株和对照菌株生长随时间变化情况；(b)2g/L香草醛添加下发酵液中乙醇浓度随时间的变化情况；(c)2g/L香草醛添加下发酵液中残余葡萄糖随时间变化情况。图7重组空载酵母S288C-HO对照菌株和重组酿酒酵母S288C-YOL032W在3g/L糠醛添加下乙醇发酵情况；其中：(a)3g/L糠醛添加下过表达菌株和对照菌株生长随时间变化情况；(b)3g/L糠醛添加下发酵液中乙醇浓度随时间的变化情况；(c)3g/L糠醛添加下发酵液中残余葡萄糖随时间变化情况。具体实施方式实施例1：磷脂合成蛋白基因YOL032W的重组酿酒酵母的构建和转化方法本专利技术中磷脂合成蛋白基因YOL032W序列来自于NCBI公共数据库，YOL032W基因的GenBank登录号为NM_001183286.1。基因的启动子用PGK1，用CYC1作为终止子，以酶切连接的方式在PGK1启动子和CYC1终止子之间分别插入YOL032W基因。然后通过限制性内切酶NotI把构建的质粒酶切成线性，转化到酿酒酵母S288C中进行整合表达。1.1酿酒酵母基因组DNA提取(1)从新培养的YPD平板上挑取酵母单菌落，接入100mL液体YPD培养基中，在30℃，150rpm的条件下过夜培养。(2)取4mL菌液，10000rpm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母，其特征在于，该菌株名称为S288C‑YOL032W，菌株的保藏编号为CGMCC No.13926，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年03月24日；该菌株携带有YOL032W基因，该基因GenBank登录号为NM_001183286.1。

【技术特征摘要】
1.一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母，其特征在于，该菌株名称为S288C-YOL032W，菌株的保藏编号为CGMCCNo.13926，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年03月24日；该菌株携带有YOL032W基因，该基因GenBank登录号为NM_001183286.1。2.一种制备如权利要求1所述的一株多抑制物胁迫耐受性酿酒酵母的方法，其特征在于，包括如下步骤：以自絮凝酵母SPSC01基因组为模板，通过PCR扩增得到的YOL032W基因连接到pHO组成型整合表达载体，线性化后转入酿酒酵母S288C，实现整合表达。3.一种制备如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：何艳艳，孜力汗，刘源涛，许建韧，白凤武，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21