一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术提供的融合蛋白S1‑TAT，包括猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S蛋白主要抗原位点的一段序列及结合在其C端的TAT蛋白转导肽碱性氨基酸富集区的11个核心氨基酸。将融合蛋白S1‑TAT通过腹腔注射或灌胃的方式免疫小鼠，可有效诱导特异性血清IgG抗体和sIgA黏膜抗体的产生，具有良好的免疫原性；TAT能够携带与其融合表达的S1蛋白穿过小肠肠壁细胞；且融合蛋白S1‑TAT对于小鼠生长没有影响。因此，本发明专利技术将TGEV S1蛋白与TAT融合表达，为预防TGEV感染提供了一种新的方法，也为猪传染性胃肠炎病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于基因生物工程
，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒S1和TAT融合蛋白及其制备方法和相关应用。
技术介绍
猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)属于冠状病毒属，是一种单股正链RNA病毒，是引起急性猪传染性胃肠炎疾病的主要病原体。该病毒主要感染猪群体的小肠器官，可迅速复制增殖，破坏小肠黏膜上皮细胞，导致肠道功能紊乱，肠膜萎缩，幼猪在感染数小时内出现呕吐、腹泻和脱水等症状。该病毒具有季节爆发性，特别在冬春两季呈群体爆发趋势，一般发病后3-7天内死亡率可达到100％，而感染了TGEV的成年猪死亡极少，但较正常猪体重下降，发育缓慢，但病毒也会随着排泄物长期潜伏在生活环境中，继而蔓延到整个猪场，甚至处于哺乳期的母猪感染了TGEV后，会加剧初生幼仔猪的死亡。一般幼猪出生后体内抗体要达到成年猪水平需要一段时间，但通过检测吮吸母乳健康幼仔猪的粪便，观察到血液内的IgG发生迅速下降，而sIgA抗体可在较长时间内保持较高的水平，可见sIgA抗体是仔猪获得被动免疫保护的重要基础(WelterMW,HorstmanMP,Welt-erCJ,etal.AnoverviewofsuccessfμlTGEVvaccinationstrategiesanddiscussiono-ntheinterrelationshipbetweenTGEVandPRCV.AdvExpMedBiol.1993；342:463-8.)。TGEV病毒粒子包裹着一层囊膜，全基因组共分为7个不分节段区域，编码着7种不同的功能蛋白，分为3种非结构蛋白和4种结构蛋白。其包膜主要由纤突蛋白(S)和膜蛋白(M)组成，在病毒核心内部，则由核衣壳蛋白(N)和膜结合蛋白(sM)一起包裹着病毒的RNA基因组与M蛋白的羧基末端相互作用。其中，S蛋白可作用于B淋巴细胞，引起体液免疫反应产生血清特异性中和抗体，对开发抗猪传染性胃肠炎病毒疫苗具有重要的研究意义。TGEV的S基因全长约为4300bp，在S蛋白的氨基末端S1区域含有4个主要抗原位点，从N末端到C末端，依次是C、B、D和A(RegueraJ,D,SantiagoC,etal.Antig-enicmodμlesintheN-terminalS1regionofthetransmissiblegastroenteritisvirusspi-keprotein.JGenVirol.2011；92(Pt5):1117-26)。C和B抗原区域是决定感染发生的位置取向所必需的基因序列，B位点空间结构较为复杂，但和A、D抗原位点一样在不同毒株之间高度保守，而C位点在碱基上略有不同。A抗原位点的氨基酸范围位于第538-591之间，是能够诱导机体发生免疫反应产生中和抗体的关键糖基化位点，存在于病毒粒子的表面上，是研究TGEV糖蛋白S免疫中和反应的热点序列；D抗原位点由至少2个以上的相关抗原表位构成，不经过细胞内的糖基化修饰作用，应用仅含D抗原位点基因免疫小鼠产生的血清特异性抗体也具有中和活性。若TGEVS蛋白缺失编码A、D位点的基因序列，则其表达产物不能诱导机体产生中和抗体(JiménezG,CorreaI,MelgosaMP,etal.Criticalepi-topesintransmissiblegastroenteritisvirusneutralizati.JVirol.1986；60(1):131-139)(GebauerF,PosthumusWP,CorreaI,etal.ResiduesinvolvedintheantigenicsitesoftransmissiblegastroenteritiscoronavirusSglycoprotein.Virology.1991；183(1):225-38)(DeDiegoM,LaviadaMD,EnjuanesL,etal.Epitopespecificityofprotectivelact-ogenicimmunityagainstswinetransmissiblegastroenteritisvirus.JVirol.1992；66(11):6502-8)。研究表明，含TGEVS基因主要抗原位点(称为S1序列)比完整长度S基因具有更好的免疫效果(任晓峰,尹杰超,司微等.猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力[J].中国兽医科学.2006；(03):203-6)。TAT蛋白转导肽是一段可以携带多种外源生物大分子穿过细胞膜进入机体细胞中发挥生理功能的多肽，分为5个功能结构区域，碱性氨基酸富集区是TAT转导肽的核心肽段，含有11个核心氨基酸(YGRKKRRQRRR)，包括6个精氨酸(R)和2个赖氨酸(K)(VivèsE,BrodinP,LebleuB.AtruncatedHIV-1Tatproteinbasicdomainrapidlytranslocatesthroughtheplasmamembraneandaccumulatesinthecellnucleus.JBiolChem；1997,272(25):16010-7)。一般在跨膜转导过程中，生物大分子由于细胞膜的相关特性不能有效的渗透到细胞中，导致药物摄入量少，TAT蛋白转导肽的发现为弥补这种不足提供了一种新的安全有效的跨膜转导方式，具有良好的应用前景。因此，首次将TGEVS1与TAT基因进行融合表达，对研究预防TGEV感染具有重要意义。
技术实现思路
为了扩大现有技术的研究范围，本专利技术的目的是提供一种猪传染性胃肠炎病毒TGEVS1与TAT基因共表达的融合蛋白S1-TAT及含有重组表达载体pGEX-6p-1-S1-TAT的大肠杆菌基因工程菌株。该菌株表达的融合蛋白S1-TAT产量较大，易于工业化生产，成本低，具有较好的免疫原性。TAT蛋白转导肽可以携带S1蛋白穿过肠壁细胞而进入血液，经过血液循环，使融合蛋白S1-TAT到达不同的组织，主动刺激机体产生针对该融合蛋白的抗体。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：本专利技术第一方面提供一种融合蛋白S1-TAT，其序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术第二方面提供一种融合蛋白S1-TAT对应的的核苷酸序列，优选编码序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术第三方面提供一种含有融合蛋白S1-TAT基因的大肠杆菌基因工程菌株，分类命名：EschierichiacoliBL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)大肠杆菌BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)，保藏编号：CCTCCNO:M2017785。该菌已于2017年12月12日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国.武汉.武汉大学。本专利技术第四方面提供一种融合蛋白S1-TAT的制备方法，其步骤如下：1、获得含有TGEVS1基因及TAT转导肽基因的重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT：人工合成重组基因S1-TAT，其序列为SEQIDNO.1所示，连接在表达载体pGEX-6p-1上，即构建了重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT；2、大肠杆菌基因工程菌的制备：将重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白S1‑TAT，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白S1-TAT，其特征在于：其序列为SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的融合蛋白S1-TAT对应的的核苷酸序列，其特征在于：编码序列为SEQIDNO.1所示。3.一种含有融合蛋白S1-TAT基因的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：其分类命名：大肠杆菌BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)，保藏编号：CCTCCNO:M2017785。4.权利要求1所述的融合蛋白S1-TAT的制备方法，包括步骤如下：1）、获得含有TGEVS1基因及TAT转导肽基因的重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT：人工合成重组基因S1-TAT，其序列为SEQIDNO.1所示，连接在表达载体pGEX-6p-1上，即构建了重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT；2）、大肠杆菌工程菌的制备：将重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到的阳性转化子经菌液PCR和基因测序鉴定为阳性的菌落即为能表...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐进平，王芳，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42