多特异性FAB融合蛋白及其使用方法技术

本公开总体上涉及多特异性FAB融合蛋白及其使用方法，具体涉及包含抗体Fab片段的多特异性Fab融合蛋白(MSFP)，所述抗体Fab片段以两个N端与融合部分(融合部分A或B)融合。包含所述Fab片段的MSFP表现出明显降低的所述Fab片段结合Fab靶标的能力。当所述MSFP通过所述融合部分与其靶标的结合而在细胞表面上成簇时，所述Fab与其靶标的结合被恢复。所述Fab与其靶标的减少的结合，特别是当所述靶标以其天然状态呈现在细胞表面上时，融合部分结合的缺失提供了诸如减少副作用的优点并允许所需的选择性和特异性的药理作用处于受控的方式。

【技术实现步骤摘要】
多特异性FAB融合蛋白及其使用方法本申请是2012年5月16日提交的申请号为201280033111.1(PCT申请号为PCT/US2012/038177)、专利技术名称为“多特异性FAB融合蛋白及其使用方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2011年5月16日提交的美国临时申请第61/486,690号的优先权，所述申请全部内容在此通过引用并入本文。关于序列表的声明以文本格式代替纸质版提供本申请相关的序列表，并且在此通过引用并入本说明书。包含所述序列表的文本文件命名为FABN_001_02WO_ST25.txt。该文本文件为188KB，创建于2012年5月16日，并通过EFS-Web以电子方式提交。背景
本公开总体上涉及多特异性Fab融合蛋白(MSFP)。具体而言，本公开的MSFP包含抗体的Fab片段，其两个N端通过可切割或不可切割的接头与融合部分融合。MSFP的Fab片段与天然的细胞表面靶标抗原以及相同抗原的某些可溶形式特异性地结合。一种或两种融合部分与细胞表面上的靶标抗原特异性地结合。相关领域的描述常规的免疫球蛋白G(IgG)为包含两个相同的免疫球蛋白重链和两个相同的免疫球蛋白轻链的四聚体分子。IgG重链有位于N端的可变区接着是第一恒定区(CH1)、铰链区和两个另外的恒定区(CH2CH3)。IgG轻链由两个结构域组成：N端可变区和C端恒定区。重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)相互作用构成了最小的抗原结合区，Fv。抗原结合区通过重链(CH1)的第一恒定区和轻链恒定区(CL)之间的相互作用并进一步通过两个恒定区之间的二硫键的形成(形成Fab片段)来稳定。CH2CH3结构域的同源二聚化(形成Fc)以及由此形成的铰链二硫键稳定了IgG的结构。因此，IgG有两个抗原结合性Fab臂，该Fab臂彼此以及与Fc结构域在方向上是相对灵活的。此外，结合区(其与抗原直接相互作用)位于N端而无需其它结构。不难想象，这种结构特点有利于抗体与抗原以最小的空间位阻干扰来相互作用。这种属性对于与细胞表面抗原的结合尤其重要，细胞表面抗原往往与复杂的细胞膜位置非常接近。近年来，已成功将全长单克隆抗体用于治疗癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病以及其他的人类疾病(Nelson,Nat.review,DrugDiscovery(2010)9:767-74)。尽管天然存在五种不同类型的免疫球蛋白(IgA、IgD、IgG、IgM和IgE)，由于有利的性质(包括高结合亲和力和高结合特异性、高生物利用度、循环中较长的血清半衰期、潜在的效应功能和工业规模的可生产性)，IgG代表了用于人类治疗的最适形式。单克隆抗体(非缀合抗体或裸抗体)目前由全球药品监督管理部门批准用于肿瘤学背景的临床应用，其通常通过以下机制之一或其组合起作用：1)阻断细胞生长信号、2)阻断向癌细胞供应血液、3)直接介导细胞凋亡、4)引发免疫效应功能，诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)、以及5)促进针对肿瘤的获得性免疫。单克隆抗体疗法已在临床上表现出生存益处。但是，在癌症患者中的总体反应率较低，并且与化疗相比存活益处较小(数月)。虽然未完全了解缺少强大的临床抗癌活性的根本原因，但研究表明，癌细胞往往迅速发展出补偿信号途径来逃避细胞死亡。此外，癌症干细胞(CSC)，其被认为是有效的癌症起始细胞，细胞增殖较不活跃，因此它们倾向于更好地维持生长信号的缺乏。近年来，ADCC被证明在抗癌抗体的临床疗效中发挥重要作用。抗体的Fc结合Fcγ受体，其中Fcγ受体有多种形式：FcγRI、FCγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FCγRIIIa和FcγRIIIb。Fc结构域对FcγRIIIa有特别高的亲和力，所述FcγRIIIa表达于自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上。Fc与FcγRIIIa的结合活化NK细胞，其随后破坏附近的癌细胞。经由蛋白改造(涉及CH2区中的多个氨基酸突变)或生产宿主细胞(CHO)系(经改造减少或消除Asn297聚糖结构中的岩藻糖化)产生的具有增强的活化FcγR结合性质的遗传改造的抗体，已在临床前研究中成功地测试具有改善的生物活性。包含增强的效应功能的IgG抗体目前在临床试验中，目的在于提高疗效。目前可用的临床数据表明这些抗体是非常有前景的。另一种抗癌的治疗方法是利用T细胞。T细胞通过巡视机体以寻找新出现的癌细胞并有效及时地清除它们而在一生中提供对癌症的防御性。在癌症治疗中利用T细胞免疫的成功的治疗方法包括：1)FDA批准使用的用于转移性黑色素瘤和转移性肾癌的Proleukin(重组IL-2)；2)FDA批准使用的用于无症状的转移性激素抵抗性前列腺癌的(Sipuleucel-T)。是一种树突状细胞疫苗，其活化离体前列腺癌特异性的细胞毒性T细胞，接着将该细胞回输至患者体内；3)FDA批准使用的用于晚期黑色素瘤的易普利姆玛(抗CTLA-4抗体以通过抑制T细胞抑制性信号通路来活化T细胞)。由于T细胞不表达Fcγ受体(FCγR)，抗肿瘤抗体不能有效地直接活化细胞毒性T细胞。许多旨在活化T细胞用于肿瘤杀伤目的的有前景的方法之一是使用双特异性抗体(bsAb)，以便直接将T细胞带至肿瘤细胞附近，导致T细胞的活化并杀伤肿瘤细胞。CD28和CD137(4-1BB)是用于双特异性靶向方法中的两种有效的T细胞共刺激受体。实例包括：CD28xNG2(Grosse-Hovestetal.,EurJImmunol33:1334-40,2003)、CD28xCD20(Otzetal.,Leukemia23:71-7,2009)和4-1BBxCD20(Liuetal.,JImmunother33:500-9,2010)。利用双特异性抗体，能够触发T活化的其他T细胞表面靶标也已被用于将其重靶向肿瘤细胞。过去已开发了多种双特异性抗体形式和多特异性抗体形式并在最近得到仔细的研究(MullerandKontermann,Biodrugs24:89-98,2010；ChamesandBaty,mAbs1:539-47,2009；DeyevandLebedenko,BioEssays30:904-918,2008)。这些形式落入以下三大类：1)基于Fc异源二聚化或与重链或轻链共价融合的IgG样双特异性分子，包括四源杂交瘤技术(Staerzetal.,PNAS83:1453-7,1986)、杵-臼技术(NatBiotechnol.16:677-81；J.Biol.Chem.285:19637-46,2010)、链交换改造结构域“SEED”技术(Davisetal.,PEDS23:195-202,2010)、与IgG的重链或轻链的C端融合(ColomaandMorrison,Nat.Biotechnol.15:159-63,1997；Shenetal.,J.Immunol.Methods318:65-74,2007；orcuttetal.,PEDS23:221-8,2010；Dongetal.,J.Biol.Chem.,286:4703-17,2011,Lazaretal.,专利申请,US20110本文档来自技高网...

【技术保护点】
多特异性Fab融合蛋白，其包含：能与CD3ε的N端结合的Fab片段；与所述Fab片段中VL的N端连接的融合部分A；或与所述Fab片段中VH的N端连接的融合部分B；或与所述Fab片段中VL的N端连接的融合部分A和与所述Fab片段中VH的N端连接的融合部分B两者。

【技术特征摘要】
2011.05.16 US 61/486,6901.多特异性Fab融合蛋白，其包含：能与CD3ε的N端结合的Fab片段；与所述Fab片段中VL的N端连接的融合部分A；或与所述Fab片段中VH的N端连接的融合部分B；或与所述Fab片段中VL的N端连接的融合部分A和与所述Fab片段中VH的N端连接的融合部分B两者。2.如权利要求1所述的多特异性Fab融合蛋白，其中所述Fab片段能结合CD3ε的第1-27位氨基酸内的表位。3.如权利要求1或权利要求2所述的多特异性Fab融合蛋白，其中所述Fab片段与非人灵长类CD3ε交叉反应。4.如权利要求1所述的多特异性Fab融合蛋白，其中：a.所述Fab片段包含：i.免疫球蛋白轻链可变区(VL)和免疫球蛋白轻链恒定区(CL)，所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO:26-28所示的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列，以及ii.免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)，所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO:23-25所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周洪星，
申请(专利权)人：健能隆医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31