本发明专利技术公开了一种优化的嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化CD19靶向性的T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体由CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。采用本发明专利技术的嵌合抗原受体CD19ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ修饰的T细胞进行体外实验时，对CD19阳性靶细胞具有很好的特异杀伤活性，且比对照的已知的CD19靶向性的T细胞有更强的功能和更高的活性。
【技术实现步骤摘要】
CD19靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体地，本专利技术涉及CD19靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用。
技术介绍
CD19分子是B淋巴细胞表面发挥特异性信号转导的受体，存在于B细胞成熟的各个阶段，在B祖细胞阶段出现并稳定持续地表达。CD19作为B细胞系特异的细胞表面分化抗原，仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达。而且，CD19分子在膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不会因为与抗体的结合而发生抗原调变,故CD19是最可靠的B细胞表面的生物标志物一。CD19通过B细胞受体调节信号传导，其在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。此外，近期关于癌基因MYC基因如何推动B淋巴细胞恶性肿瘤的发生与发展的研究，发现CD19对稳定Myc蛋白来说是绝对必要的，当Myc基因是稳定的，并处于较高水平时，Myc基因会促使癌症发展，并且，Myc蛋白水平高的患者更可能死于淋巴瘤。CD19可能是控制Myc基因通路上的开关，而控制通断开关可能代表了治疗淋巴细胞肿瘤的有力工具。基于以上现象，故CD19成为治疗CD19阳性B细胞恶性肿瘤的发生与发展的细胞的一个重要靶点。CD19在大多数B细胞淋巴瘤(如DLBCL、FL和套细胞淋巴瘤)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和一部分急性骨髓性白血病中都有高水平的表达。而CD19在造血干细胞、浆细胞及其他人体正常组织均不表达，因此CD19的靶向治疗不会与其他正常组织组织发生交叉反应，主要副作用是B细胞缺乏。目前抗CD19特异抗体Blinatumomab已获得美国FDA批准用于治疗复发或难治性费城染色体阴性B细胞急性淋巴细胞白血病。针对CD19的CART细胞治疗也在B细胞恶性肿瘤的临床研究获了良好的疗效。因此，CD19在临床实践中已被证明是治疗B细胞性血液肿安全、有效的靶点。细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。本领域技术人员一直致力于开发新的细胞免疫疗法，以提高细胞免疫疗法的效果，并降低其副作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是优化CD19靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用。本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)(序列)，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域(即，scFv)如下式所示：VL－VH其中，VH为抗体重链可变区；VL为抗体轻链可变区；“－”为连接肽或肽键。在另一优选例中，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.5所示的CDR1，SEQIDNO.6所示的CDR2，和SEQIDNO.7所示的CDR3。在另一优选例中，所述抗体重链可变区具有SEQIDNO.8所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述抗体轻链可变区包括一下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.9所示的CDR1'，SEQIDNO.10所示的CDR2'，和SEQIDNO.11所示的CDR3'。在另一优选例中，所述抗体轻链可变区具有SEQIDNO.12所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式所示：L－VL－VH－H－TM－4-1BB－CD3ζ其中，L为任选的引导序列(Leadersequence，即信号肽序列)；H为绞链区；TM为跨膜结构域；4-1BB为为源于4-1BB的共刺激分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；VH和VL分别如上所述。在另一优选例中，L的序列如SEQIDNO.22或SEQIDNO.24所示。在另一优选例中，H的序列包括SEQIDNO.14所示的氨基酸序列；优选地，H的序列如SEQIDNO.15所示。在另一优选例中，TM的序列如SEQIDNO.17所示。在另一优选例中，4-1BB的序列如SEQIDNO.18或27所示。在另一优选例中，CD3ζ的序列如SEQIDNO.20或SEQIDNO.33所示。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域如SEQIDNO.13所示。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本专利技术第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD8a的铰链区核酸序列：(a)编码如SEQIDNO.14或15所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.16所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.16所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQIDNO.15所示氨基酸序列的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD8a的跨膜区的核酸序列：(a)编码如SEQIDNO.17所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.26所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.26所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQIDNO.17所示氨基酸序列的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述4-1BB(CD137)的胞内信号结构域的核酸序列：(a)编码如SEQIDNO.18或27所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.19所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.19所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQIDNO.18所示氨基酸序列的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列：(a)编码如SEQIDNO.20或32所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.21或33所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.21或33所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQIDNO.20所示氨基酸序列的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：(a)编码如SEQIDNO.3或SEQIDNO.1所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.2所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQIDNO.4或SEQIDNO.2所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，并且编码SEQIDNO.3或SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。在另一优选例中，所述核酸分子还包括编码前导序列(引导序列，信号肽)的多核苷酸，所述前导序列的氨基酸序列如SEQIDNO.22或SEQIDNO.24所示；优选地所述编码前导序列(信号肽)的多核苷酸如SEQIDNO.23或25所示。在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域如下式所示：VL－VH其中，VH为抗体重链可变区；VL为抗体轻链可变区；“－”为连接肽或肽键；优选地，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.5所示的CDR1，SEQ ID NO.6所示的CDR2，和SEQ ID NO.7所示的CDR3；和/或所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.9所示的CDR1'，SEQ ID NO.10所示的CDR2'，和SEQ ID NO.11所示的CDR3'。
【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域如下式所示：VL－VH其中，VH为抗体重链可变区；VL为抗体轻链可变区；“－”为连接肽或肽键；优选地，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.5所示的CDR1，SEQIDNO.6所示的CDR2，和SEQIDNO.7所示的CDR3；和/或所述抗体轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.9所示的CDR1'，SEQIDNO.10所示的CDR2'，和SEQIDNO.11所示的CDR3'。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体如下式所示：L－VL－VH－H－TM－4-1BB－CD3ζ其中，L为任选的引导序列(Leadersequence，即信号肽序列)；H为绞链区；TM为跨膜结构域；4-1BB为为源于4-1BB的共刺激分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；VH和VL分别如上所述。3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，L的序列如SEQIDNO.22或24所示；和/或H的序列包括SEQIDNO.14所示的氨基酸序列；优选地，H的序列如SEQIDNO.15所示；和/或TM的序列如SEQIDNO.17所示；和/或4-1BB的序列如SEQIDNO.18所示；和/或CD3ζ的序列如SEQIDNO.20或33所示。4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚意弘，朱侍贵，姚昕，李志远，何佳平，朱蔚，朱琳，王庆霞，林南静，张莉，黄家琪，
申请(专利权)人：上海赛比曼生物科技有限公司，无锡赛比曼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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