一种抗体‑海兔毒素偶联物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗体‑海兔毒素偶联物的制备方法，包括以下步骤：(1)提供C端具有LPXTG序列的抗MART‑1蛋白递呈肽EAAGIGILTV/HLA‑A2复合物的单克隆抗体、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；(2)在Sortase A酶催化下，LPXTG序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述单克隆抗体与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗体‑海兔毒素偶联物。本发明专利技术通过定点偶联使每分子的抗体带上4分子的MMAE毒素，均一性良好，且在体内实验中展示了良好的肿瘤杀伤能力；与现有ADCs靶点相比，CLA12‑vcMMAE ADCs拓展了目前ADCs靶点的选择面，论证了胞内蛋白通过MHC I分子的递呈也可以作为ADCs药物靶点的这一观点。

【技术实现步骤摘要】
一种抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物制药
，特别是涉及一种抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。
技术介绍
MART-1蛋白是一种只在黑色素细胞和大部分黑色素瘤细胞中才会表达的黑色素瘤相关抗原，并且在黑色素瘤细胞中呈高表达，据不完全统计，100％的黑色素瘤样本都有MART-1蛋白的表达(BarrowC等，ClinCancerRes.2006Feb1；12(3Pt1):764-771)。因此，选择以MART-1蛋白为靶点设计的药物将在黑色素瘤中有较为广泛的应用。进20年来，单克隆抗体领域的快速发展使其在临床的肿瘤治疗领域有着举足轻重的作用，例如西妥昔单抗，曲妥珠单抗，利妥昔单抗等一系列单克隆抗体都在各自的肿瘤适应症上均表现出了良好的临床治疗效果。他们通常是通过抑制肿瘤细胞的关键信号传导通路和Fc段诱导产生ADCC，CDC效应来达到抑制肿瘤细胞生长和杀伤肿瘤细胞的目的(WeinerLM等，NatRevImmunol.2010May；10(5):317-327.)。抗体偶联药物(Antibody-drugconjugates，ADCs)是一种结合了单克隆药物和化学修饰/偶联技术的新型生物药物，它将单克隆抗体和毒性小分子通过linker技术连接在一起，不仅具有单克隆药物优良的靶向性又具有小分子毒物的高细胞毒性，使其能快速、精准的到达肿瘤部位，并在被肿瘤细胞内吞之后在细胞内释放毒性小分子，达到更快更强的杀伤肿瘤细胞的目的。然而我们注意到，无论是临床使用的单克隆抗体还是抗体偶联药物，他们所针对的靶点仍然是细胞膜表面的膜蛋白胞外区，而对于胞内的高表达或者突变的肿瘤相关蛋白仍然无可奈何。主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex)，简称MHC，具体分为两类。其中MHCI类分子复合物由MHCI类分子，β2-微球蛋白和长度为8-11个氨基酸的递呈肽构成，其中MHCI类分子又可以主要分为HLA-A、B、C三大类。细胞通过自身的MHCI类分子将由蛋白酶体水解自身蛋白产生的多肽递呈至细胞表面(YorkIA等，AnnuRevImmunol.1996；14:369-396.)。基于这一理论，黑色素瘤相关抗原MART-1蛋白的26-35位氨基酸：EAAGIGILTV形成的多肽正可以被HLA-A2分子递呈至细胞表面。正是这一理论使得胞内蛋白也可以成为抗体乃至抗体偶联药物的靶点。单克隆抗体具有稳定的结构和良好的靶向性，但是普通的偶联方式如氨基，巯基的偶联方式，有可能会使得抗体的稳定性或者靶向性下降。SortaseA是从金黄色葡萄球菌中分离的催化转肽反应的酶，其184位的半胱氨酸亲核攻击LPXTG(X表示天然氨基酸中任意一种)标签中苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间的肽键，形成共价硫代中间体，同时释放出甘氨酸及其羧基C末端肽段。该中间体通过捕获溶剂中的甘氨酸底物从而在苏氨酸和捕获的甘氨酸底物之间形成新的肽键，释放出sortaseA酶进行下一步催化。由于该反应特异性高、操作简单、反应条件温和，sortaseA已被广泛用于蛋白质工程和蛋白质定点修饰。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供了一种针对EAAGIGILTV/HLA-A2的抗体与海兔毒素(MonomethylauristatinE，MMAE)偶联形成的抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。一种抗体-海兔毒素偶联物的制备方法，包括以下步骤：(1)提供C端具有LPXTG序列的抗MART-1蛋白递呈肽EAAGIGILTV/HLA-A2复合物的单克隆抗体、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；(2)在SortaseA酶催化下，LPXTG序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述单克隆抗体与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗体-海兔毒素偶联物。所述抗MART-1蛋白递呈肽EAAGIGILTV/HLA-A2复合物的单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。所述单克隆抗体的重链和轻链的C端均连接有LPXTG序列。C端位于恒定区，远离抗体的可变区，所以偶联后对抗体活性影响较小。重链轻链的C端均连接LPXTG序列，用于偶联海兔毒素，可以尽量增加单个抗体上偶联的海兔毒素的比例，一分子抗体包括两条重链和两条轻链，这样理论上一份子抗体可以偶联四分子的海兔毒素，抗体携带的药物比例高。所述单克隆抗体的重链和轻链在LPXTG序列后连接GWSHPQFEK序列。该序列可以增加sortaseA酶与抗体末端之间复合物的稳定性，从而增加偶联效率，并且偶联后会随着sortaseA酶识别序列末尾的甘氨酸残基一起被切除，不影响最终抗体-海兔毒素偶联物的活性。所述单克隆抗体的轻链LPXTG序列之前连接柔性接头，所述柔性接头为GGGGS五肽。引入柔性接头，克服了之前抗体轻链上无法偶联带寡甘氨酸的毒性药物的问题，且偶联效率大大提高，得到更高药物抗体偶联比(DAR)的抗体偶联药物。所述寡甘氨酸接头为GGG序列，所述寡甘氨酸接头与海兔毒素或海兔毒素衍生物之间设有缬氨酸-瓜氨酸二肽接头。缬氨酸-瓜氨酸二肽接头可在溶酶体酶cathepsinB作用下断开。本专利技术又提供了所述制备方法制备的抗体-海兔毒素偶联物。本专利技术还提供了所述的抗体-海兔毒素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，包括所述的抗体-海兔毒素偶联物。所述肿瘤为HLA-A2、MART-1双阳性的黑色素瘤。本专利技术通过定点偶联使每分子的抗体带上4分子的MMAE毒素，均一性良好，且在体内实验中展示了良好的肿瘤杀伤能力；与现有ADCs靶点相比，CLA12-vcMMAEADCs拓展了目前ADCs靶点的选择面，论证了胞内蛋白通过MHCI分子的递呈也可以作为ADCs药物靶点的这一观点。附图说明图1为CLA12ADCs与CLA12单克隆抗体在还原状态下经高效液相PLRP-反向柱的分析结果图。图2为CLA12ADCs与CLA12单克隆抗体在非还原状态下经高效液相HIC柱的分析结果图。图3为GGG-vcMMAE经质谱分析后的二级碎片图。图4为经胰酶消化后的CLA12ADCs多肽经质谱分析后，提取3个GGG-vcMMAE特征离子后的结果图，其中图A、B、C为三个特征离子分析图，图D为总的质谱分析图。图5为经胰酶消化后的CLA12ADCs多肽经质谱分析后，在紫外吸收图和质谱一级图中提取带有LPETGGG-vcMMAE目标肽的特征峰图，其中图A为紫外吸收图，图B为质谱一级图。图6为经胰酶消化后的CLA12ADCs多肽经质谱分析后，抗体重链C末端带有LPETGGG-vcMMAE目标肽的二级碎片图。图7为经胰酶消化后的CLA12ADCs多肽经质谱分析后，抗体轻链C末端带有LPETGGG-vcMMAE目标肽的二级碎片图。图8为CLA12ADCs与CLA12单克隆抗体在5μg/mL的浓度下用流式细胞分析技术对靶细胞MEL624.38亲和力的分析图。图9为CLA12ADCs与CLA12单克隆抗体对MEL624.38，MCF7，SK-MEL28和K562细胞系的杀伤效果图。图10为CLA12ADCs与CL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体‑海兔毒素偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供C端具有LPXTG序列的抗MART‑1蛋白递呈肽EAAGIGILTV/HLA‑A2复合物的单克隆抗体、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；(2)在Sortase A酶催化下，LPXTG序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述单克隆抗体与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗体‑海兔毒素偶联物。

【技术特征摘要】
1.一种抗体-海兔毒素偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提供C端具有LPXTG序列的抗MART-1蛋白递呈肽EAAGIGILTV/HLA-A2复合物的单克隆抗体、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；(2)在SortaseA酶催化下，LPXTG序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述单克隆抗体与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗体-海兔毒素偶联物。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗MART-1蛋白递呈肽EAAGIGILTV/HLA-A2复合物的单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链的C端均...

【专利技术属性】
技术研发人员：来骏，吴姗姗，王赟，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33