抑制TNFα的稳定和可溶的抗体制造技术

本发明专利技术涉及特异于TNF的特别稳定且可溶的scFv抗体和Fab片段，其包含就稳定性、溶解性、TNF的体外和体内结合以及低免疫原性进行了优化的特定轻链和重链序列。所述抗体设计用于诊断和/或治疗TNF介导的病症。还公开了用于表达本发明专利技术的重组抗体的核酸、载体和宿主细胞、用于分离其的方法以及所述抗体在医药中的用途。

【技术实现步骤摘要】
抑制TNFα的稳定和可溶的抗体本申请是申请日为2009年6月25日、专利技术名称为“抑制TNFα的稳定和可溶的抗体”的中国专利技术专利申请No.200980123825X的分案申请。相关信息本申请要求2008年6月25日提交的US61/075,640和2008年6月26日提交的US61/075,956的优先权。专利技术背景肿瘤坏死因子α(TNFα，也称为恶液质素)是由许多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)响应内毒素或其他刺激物而产生的天然发生的哺乳动物细胞因子。TNFα是炎性、免疫和病理生理反应的主要介体(mediator)(Grell,M.，等人(1995)Cell,83:793-802)。可溶性TNFα通过前体跨膜蛋白的断裂而形成(Kriegler，等人(1988)Cell53:45-53)，并且分泌的17kDa多肽装配成可溶性同三聚体复合物(Smith，等人(1987),J.Biol.Chem.262:6951-6954；关于TNFA的综述，参见Butler，等人(1986),Nature320:584；Old(1986),Science230:630)。然后这些复合物结合在多种细胞上发现的受体。结合产生一系列促炎效应，包括(i)释放其他促炎细胞因子例如白细胞介素IL-6、IL-8和IL-1，(ii)释放基质金属蛋白酶和(iii)上调内皮粘附分子的表达，从而通过诱集白细胞进入血管外组织来进一步放大炎性和免疫级联。许多病症与升高的TNFα水平关联，它们中的许多具有显著的医学重要性。已显示TNFα在许多人类疾病中上调，所述疾病包括慢性疾病例如类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎、脓毒症、充血性心力衰竭、支气管哮喘(asthmabronchiale)和多发性硬化。人TNFα转基因小鼠组成型地产生高水平的TNFα并且发展与RA相似的自发性、破坏性多关节炎(Keffer等人1991，EMBOJ.，10,4025-4031)。TNFα因而被称为促炎细胞因子。TNFα现已被认为是RA(其为特征在于多关节炎症和破坏的慢性进行性和使人虚弱的疾病，具有全身性的发热以及不适和疲劳症状)发病机制中的关键因子。RA还导致慢性滑液炎症，且经常进展至关节软骨和骨破坏。在RA患者的滑液和外周血中都发现了增加的TNFα水平。当给RA患者施用TNFα阻断剂时，他们减少了炎症，改善了症状和延缓了关节损伤(McKown等人(1999)，ArthritisRheum.42:1204-1208)。在生理学上，TNFα还与抵抗特定感染的保护作用关联(Cerami.等人(1988)，Immunol.Today9:28)。TNFα由已被革兰氏阴性细菌的脂多糖活化的巨噬细胞释放。因此，TNFα似乎为参与和细菌性脓毒症关联的内毒性休克的发展和发病机制的具有中心重要性的内源性介体(Michie，等人(1989)，Br.J.Surg.76:670-671.；Debets.等人(1989)，SecondViennaShockForum，p.463-466；Simpson，等人(1989)Crit.CareClin.5:27-47；Waage等人(1987).Lancet1:355-357；Hammerle.等人(1989)SecondViennaShockForump.715-718；Debets.等人(1989)，Crit.CareMed.17:489-497；Calandra.等人(1990)，J.Infect.Dis.161:982-987；Revhaug等人(1988)，Arch.Surg.123:162-170)。至于其他器官系统，还已显示TNFα在中枢神经系统中，特别是在神经系统的炎性和自身免疫性病症(包括多发性硬化、格-巴二氏综合征(Guillain-Barresyndrome)和重症肌无力)和在神经系统的退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病)中起着至关重要的作用。TNFα还牵涉视网膜和肌肉的相关系统的病症(包括视神经炎、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、皮肌炎、肌萎缩侧索硬化和肌营养不良)以及对神经系统的损伤(包括创伤性脑损伤、急性脊髓损伤和中风)。肝炎是除了其他诱发剂(trigger)以外可由病毒感染(包括EB病毒(Epstein-Barrvirus)、巨细胞病毒和甲型-戊型肝炎病毒)引起的另一种TNFα相关炎性病症。肝炎引发肝门和小叶区域中的急性肝炎症，然后引发纤维化和肿瘤进展。TNFα还可介导引起主要的癌症发病率和死亡率的癌症的恶病质(TisdaleMJ.(2004)，LangenbecksArchSurg.389:299-305)。TNFα在炎症、细胞免疫应答和许多疾病的病理学中所起的至关重要的作用已导致对于TNFα的拮抗剂的研究。设计用于治疗TNFα介导的疾病的一种TNFα拮抗剂是特异性结合TNFα，从而阻断其功能的抗体或抗体片段。抗TNFα抗体的使用已显示，TNFα的阻断可逆转由TNFα促成的效应，包括IL-1、GM-CSF、IL-6、IL-8、粘附分子和组织破坏的减少(Feldmann等人(1997)，Adv.Immunol.1997:283-350)。最近已成为商购可获得的TNFα的特异性抑制剂包括已在RA和克罗恩病的治疗中显示临床效果的抗TNFα的单克隆嵌合小鼠-人抗体(英利昔单抗、RemicadeTM；CentocorCorporation/Johnson&Johnson)。以团注的形式(这导致稳定地减少直至下一次注射的高起始浓度)每周一次或以更长的间隔静脉内或皮下施用所有市售的TNFα抑制剂。它们的分布容积(volumeofdistribution)是有限的。尽管获得这些进展，但仍然需要用于治疗TNFα相关病症例如RA的新型有效的抗体或其他免疫结合剂。特别地，迫切需要对于关节炎和其他TNFα介导的病症的有效且持续的治疗具有最佳功能性质的免疫结合剂，其允许更灵活的施用和配制方式并且具有提高的组织渗透性从而增加分布容积。专利技术概述因此，本专利技术的一般目的是提供在体外和体内特异性结合TNFα的稳定和可溶的抗体或其他免疫结合剂。在优选实施方案中，所述免疫结合剂是scFv抗体或Fab片段。本专利技术提供了特异于TNFα的稳定和可溶的scFv抗体和Fab片段，其包含就稳定性、溶解性、对TNFα的体外和体内结合以及低免疫原性进行最优化的特定轻链和重链序列。所述抗体经设计用于TNFα介导的病症的诊断和/或治疗。还公开了用于表达本专利技术的重组抗体的核酸、载体和宿主细胞、用于分离其的方法和所述抗体在医药中的用途。附图概述图1描述了来自44个抗-TNFRabMab杂交瘤的上清液在结合TNFα(Biacore测定)和中和其活性(L929测定)中的相对能力。图2描述了20种抗TNFRabMab单链抗体和7种人源化抗TNF单链抗体在选择性结合TNFα中的能力(ELISA分泌测定，请注意对于该测定使用来自细菌培养物的上清液，未就单链抗体的含量对其进行标准化)。图3描述了EP43max(图3A)和EP34max(图3B)对人TNFα的结合动力学。图4描述了EP43max的效力(空心方块)，ESBA105的效力(实心圆本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性结合人TNFα的免疫结合剂，所述免疫结合剂包含:(i)人重链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的CDR H1、CDR H2和CDR H3序列，其中所述人重链可变区构架具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90，或者具有一个或多个保守置换使得该人重链可变区构架序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90具有至少95％的同一性；和(ii)人轻链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的CDR L1、CDR L2和CDR L3序列，其中所述人轻链可变区构架序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:91，或者具有一个或多个保守置换使得该人轻链可变区构架序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:91具有至少95％的同一性；其中，所述源于兔免疫结合剂的CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3的序列分别如SEQ ID NO:33‑38所示，其中所述免疫结合剂具有≤1nM的针对TNFα的KD。

【技术特征摘要】
2008.06.25 US 61/075,640;2008.06.25 US 61/075,692;1.特异性结合人TNFα的免疫结合剂，所述免疫结合剂包含:(i)人重链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，其中所述人重链可变区构架具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:89或SEQIDNO:90，或者具有一个或多个保守置换使得该人重链可变区构架序列与SEQIDNO:2、SEQIDNO:89或SEQIDNO:90具有至少95％的同一性；和(ii)人轻链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，其中所述人轻链可变区构架序列具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:91，或者具有一个或多个保守置换使得该人轻链可变区构架序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:91具有至少95％的同一性；其中，所述源于兔免疫结合剂的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列分别如SEQIDNO:33-38所示，其中所述免疫结合剂具有≤1nM的针对TNFα的KD。2.权利要求1的免疫结合剂，其中所述人重链可变区构架是或包含SEQIDNO:89或SEQIDNO:90并且所述人轻链可变区构架序列是或包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:91。3.权利要求2的免疫结合剂，其中所述重链可变区构架具有下列氨基酸中的一个或多个：根据AHo编号系统的位置H24处的苏氨酸(T)、位置H25处的缬氨酸(V)、位置H56处的甘氨酸(G)或丙氨酸(A)、位置H82处的赖氨酸(K)、位置H84处的苏氨酸(T)、位置H89处的缬氨酸(V)和位置H108处的精氨酸(R)。4.权利要求1-3之任何一项的免疫结合剂，其中所述重链包含下面的增强溶解性的置换：(a)位置12处的丝氨酸(S)；(b)位置103处的苏氨酸(T)；和(c)位置144处的苏氨酸(T)。5.权利要求1的免疫结合剂，其包含具有选自SEQIDNO:77和SEQIDNO:79的序列的重链可变区(VH)，和具有选自SEQIDNO:78和SEQIDNO:80的序列的轻链可变区(VL)。6.特异性结合人TNFα的免疫结合剂，所述免疫结合剂包含:(i)人重链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，其中所述人重链可变区构架与SEQIDNO:1具有至少90％的同一性；和(ii)人轻链可变构架序列和源于兔免疫结合剂的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，其中所述人轻链可变区构架序列与SEQIDNO:2具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·波拉斯，T·冈德，D·厄里什，
申请(专利权)人：艾斯巴技术诺华有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH