高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法技术

技术编号:17767703 阅读:39 留言:0更新日期:2018-04-21 21:18
本发明专利技术公开了一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法。该方法将猪瘟病毒浓缩和纯化时,先采用切向流超滤,然后过琼脂糖凝胶过滤层析柱;筛选抗CSFV单克隆抗体时,先采用猪瘟抗体检测试纸检测,再采用IPMA检测,最后采用间接ELISA的方法筛选。公开了依据所述高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法所制备的杂交瘤细胞株。公开了依据所述高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法所制备的抗CSFV单克隆抗体。将所述抗CSFV单克隆抗体在CSFV定性或定量检测中的应用。并利用所述抗CSFV单克隆抗体检测CSFV的阻断 ELISA试剂盒。本发明专利技术的方法能够用于大批量样本检测,低成本、既简单又快速且灵敏。

【技术实现步骤摘要】
高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法
本专利技术涉及疫苗制备
,具体涉及一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
猪瘟(classicalswinefever,CSF)在中国被列为一类传染病,病原是猪瘟病毒。猪瘟病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属,其分子量约为4×106,病毒粒子大小大约在40~70nm,略呈圆形或椭圆形,具有脂蛋白囊膜,从电镜照片中可观察到囊膜围绕着等轴的核心,内部核心直径大约30nm,核衣壳呈二十面体对称,6~8nm类似穗样的纤突结构存在于病毒粒子的表面,同种属成员的还包括羊边界病病毒和牛黏膜病病毒。CSFV是单股正链RNA病毒,具有感染性,而且本身就可作为mRNA,仅含有一个大的开放阅读框,其两端为高度保守的非编码区,而且5′端无甲基化帽子结构,3′端无多聚腺苷酸尾巴,ORF编码一个多聚蛋白前体包含有3898个氨基酸残基的,在宿主细胞和病毒自身的酶共同裂解作用下可裂解为12种蛋白,包括4种结构蛋白和8种非结构蛋白。其中编码病毒结构蛋白的基因靠近基因组5′端,分别为C、E0、E1、E2。E2囊膜糖蛋白编码373个氨基酸残基,位于CSFV多聚蛋白的第690~1062位氨基酸残基,编码E2蛋白的结构基因是与病毒毒力有关的基因,它是一种中和性抗原蛋白,除了能够诱导机体产生中和抗体,还能够激发产生保护性免疫应答,它是CSFV诱导机体产生中和抗体的主要抗原蛋白。E2蛋白由3~8个氨基酸残基组成的抗原表位根据结构的差别,分为两种抗原表位,分别为连续性及不连续性。连续性抗原表位见于T细胞表位和部分B细胞表位,又称为线性表位,不连续抗原表位只见于B细胞抗原表位,又称为构象型表位。CSFV与BVDV和BDV的区别主要表现在E2蛋白上。E0蛋白的分子量约为44~48kDa。E0以分子质量约100kDa的同源二聚体的形式出现在CSFV感染的细胞或病毒粒子中,感染CSFV的细胞会分泌大量的E0到细胞培养液中。E0蛋白的C末端氨基酸和N末端氨基酸分别为Ala-494和Glu-268。E0蛋白没有跨膜结构,其C末端存在一个膜锚定结构,但与囊膜结合力较弱,很容易从囊膜上游离下来,该膜锚定结构对子代病毒的感染性至关重要。E0蛋白位于CSFV的表面,E0的一些抗原表位是暴露在外的,它既是一种结构蛋白,而且还是一种功能性蛋白,存在大量重要的抗原表位。E0蛋白具有RNase活性,能够降解病毒和细胞的RNA,它是一种尿嘧啶特异的核酸酶,可以表现出多种生物活性。RNase除了能够降解RNA外,还具有神经毒性,抗蠕虫、抗肿瘤,免疫调节等作用。E0蛋白在病毒入侵易感细胞时发挥着重要作用,例如CSFV通过E0和E2两个囊膜糖蛋白分别作用于细胞表面的不同受体来完成对SK-6细胞的感染。E0吸附细胞的能力被抑制后,病毒粒子就得依靠E1和E2介导进入宿主细胞内。E0同E2囊膜糖蛋白一样均可诱发猪产生抗CSFV的中和性抗体。目前,RT-PCR、巢式RT-PCR、限制性片段长度-巢式RT-PCR(RFLP)、实时定量PCR、RT-LAMP等检测方法均已用于检测猪瘟病毒。然而,此类方法成本高,不适合大批量样品的检测;比较烦琐而且费时费力,无法在基层推广应用。因此,急需一种用于大批量样本检测的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法,以便于低成本、既简单又快速且灵敏的测定猪瘟病毒抗原。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法。为解决上述技术问题,本专利技术采用如下技术方案:经长期研究发现,目前兽用单克隆抗体的制备中,免疫原含有较多的动物组织、细胞成分和培养基中的蛋白质等杂质都易使接种者产生过敏等不良的反应,因此需要通过纯化技术去除如培养基中的杂蛋白、糖脂类及核酸等大部分生物源性杂质,完成免疫活性成分的浓缩富集和纯化工作,这样可大大地降低甚至避免接种后发生的副反应发生率,更加安全有效。本专利技术具体技术方案如下:设计一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:(1)制备免疫原:培养猪瘟病毒后,采用先切向流超滤,后过琼脂糖凝胶过滤层析柱的方法将猪瘟病毒浓缩和纯化;(2)以所述浓缩和纯化后的免疫原免疫小鼠;(3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞,获得杂交瘤细胞;(4)采用先猪瘟抗体检测试纸检测,再IPMA检测结合间接ELISA的方法筛选阳性杂交瘤细胞进行克隆;(5)对阳性克隆进行克隆化培养,得猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株;(6)将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。优选的,在步骤(1)中,所述切向流超滤时,真空泵进口压力为0.1MPa,回流压力为0.05MPa,样品反复被50kDa超滤膜截留收集于收样杯中,直至浓缩体积至20mL。优选的,在步骤(1)中,所述琼脂糖凝胶过滤层析柱为Sepharose4FastFlow,流速为0.3mL/min。优选的,所述间接ELISA的方法包括以下步骤:a.包被:使用0.05MCBS将E0-E2融合蛋白包被于96孔板,每孔100µL,4℃包被过夜;b.封闭:用5%脱脂奶封闭,37℃作用1h,PBST洗涤三次;c.样品:使用PBS稀释杂交瘤上清等进行检测,每孔100µL,37℃,30min后,PBST洗涤三次;d.酶标二抗的反应:每孔加入100µL1:1000倍稀释的羊抗猪或抗鼠的酶标二抗,37℃,30min后,PBST洗涤三次;e.显色与终止:将TMB显色试剂每孔加入100µL,显色5min后加入2MH2SO4终止反应,测定OD450值。将所述高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法制备的抗CSFV单克隆抗体在CSFV定性或定量检测中的应用。由所述制备方法制备的抗CSFV单克隆抗体所制备的检测CSFV的阻断ELISA试剂盒。优选的,其中抗原包被的浓度为0.625~5μg/mL,待检血清稀释度为1:1~50。优选的,其中封闭液为5%脱脂奶、1%BSA、1%OVA、2%明胶中的至少一种。优选的,其中酶标单抗的浓度为1:2000~16000,酶标单抗的孵育时间为0.5~2h。优选的,其中底物显色的作用时间为5~20min。与现有技术相比,本专利技术的有益技术效果在于:1.本专利技术的方法中凝胶过滤层析技术操作条件较温和、操作方法较简单且具有较好的重复性。2.本专利技术的方法中凝胶过滤层析技术操作简单,方便操作人员对样品峰进行收集;且成本低,只需一台蠕动泵和一台紫外检测器便可进行,不需要价格昂贵的液相色谱系统。3.本专利技术的方法采用超滤结合琼脂糖凝胶柱,可有高效去除如培养基中的杂蛋白、糖脂类及核酸等大部分生物源性杂质,完成对病毒的免疫活性成分的浓缩富集和纯化工作。4.本专利技术的方法首先采用猪瘟抗体检测试纸筛选,一次性、短时间可以筛除与细胞血清等发生的非特异性的反应,从而提高了筛选效率,检测后再用E0-E2融合蛋白包被的间接ELISA进一步验证出反应特异且反应性强的杂交瘤细胞,同时用IPMA筛选,得到即能与E0-E2融合蛋白反应的又能与CSFV反应的单克隆抗体细胞株。5.本专利技术的方法建立了猪瘟抗体检测试纸、IPMA和间接ELISA的方法相结合的方式进行筛选,多种筛选方法相结合提高了筛选的阳性率及特异性。6.本专利技术的方法筛选到既能与猪瘟病毒本文档来自技高网
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高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法

【技术保护点】
一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:(1)制备免疫原:培养猪瘟病毒后,采用先切向流超滤浓缩,后过琼脂糖凝胶过滤层析柱的方法将猪瘟病毒纯化;(2)以所述浓缩和纯化后的免疫原免疫小鼠;(3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞,获得杂交瘤细胞;(4)采用先猪瘟抗体检测试纸检测,再IPMA检测结合间接ELISA的方法筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆;(5)对阳性克隆进行克隆化培养,得猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株;(6)将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:(1)制备免疫原:培养猪瘟病毒后,采用先切向流超滤浓缩,后过琼脂糖凝胶过滤层析柱的方法将猪瘟病毒纯化;(2)以所述浓缩和纯化后的免疫原免疫小鼠;(3)融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞,获得杂交瘤细胞;(4)采用先猪瘟抗体检测试纸检测,再IPMA检测结合间接ELISA的方法筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆;(5)对阳性克隆进行克隆化培养,得猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株;(6)将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述切向流超滤时,真空泵进口压力为0.1MPa,回流压力为0.05MPa,样品反复被50kDa超滤膜截留收集于收样杯中,直至浓缩体积至20mL。3.根据权利要求1所述的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述琼脂糖凝胶过滤层析柱为Sepharose4FastFlow,流速为0.3mL/min。4.根据权利要求1所述的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法,其特征在于,在步骤(4)中,所述间接ELISA的方法包括以下步骤:a.包被:使用0.05MCBS将E0-E2融合蛋白包被于96孔板,每孔100µL,4℃包被过夜;b.封闭:用5%脱脂...

【专利技术属性】
技术研发人员:王瑞宁李存法马霞赵孟孟陈忠杰卢婷婷刘永录宋幸辉
申请(专利权)人:河南牧业经济学院
类型:发明
国别省市:河南,41

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