一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，ESI/MS检测分子量为974.12Da。本发明专利技术也公布了该鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法。有益效果为：本发明专利技术所公开鲻鱼鱼鳞铁螯合肽具有高的铁螯合活性，将其用于补铁保健品，可大大提高人体对铁离子的吸收；所公开的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法条件温和，铁螯合肽的提取率高，纯度大，苦味和腥味小，生物活性好，使鲻鱼鱼鳞变废为宝，具有良好的社会经济效益；鲻鱼鱼鳞的酶解过程中酶的利用度高，单位酶产肽量大，产物的抑制效应小。

【技术实现步骤摘要】
一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽及其制备方法
本专利技术涉及水产品精深加工
，特别是涉及一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽及其制备方法。
技术介绍
生物活性肽是指由20个氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，食用安全性极高，是当前极具发展前景的功能因子，成为药物及保健品研究的热点。目前，蛋白酶解生产的活性肽主要来源于陆地蛋白源，而海洋生物生存环境明显区别于陆地环境，其蛋白质的氨基酸组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同。因此，以海洋生物资源为原料，利用酶工程技术就可能开发出系列天然、高效、新颖的生物活性肽。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，该肽具有高的铁螯合活性，将其用于补铁保健品，可大大提高人体对铁离子的吸收。本专利技术的另一目的是提供一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，该方法条件温和，铁螯合肽的提取率高，纯度大，生物活性好，使鲻鱼鱼鳞变废为宝，具有良好的社会经济效益。具体而言，本专利技术一方面提供了一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，其氨基酸序列为：Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu，ESI/MS检测分子量为974.12Da。该肽具有高的铁螯合活性，与铁所生成的螯合物分子量小，能够顺利通过肠黏膜，大大提高了人体对铁离子的吸收。在本专利技术的另一方面，还提供了一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，包括以下步骤：鲻鱼鱼鳞的预处理：取鲻鱼鱼鳞，加入NaOH溶液脱除非胶原蛋白，再加入EDTA溶液，经浸泡、干燥得脱钙鱼鳞，该条件下，鱼鳞中非胶原蛋白和钙的去除率高，减少了产品铁螯合肽的灰分含量，提高了铁螯合肽的纯度，降低了产品的苦味和腥味；鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备：按照料液比1g:5～8mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3～5d，12000g离心20～25min后取上清液，加入NaCl至溶液终浓度为0.8～1.0mol/L，静置61～90min，15000g离心15～20min得沉淀物，冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白，提取条件温和，不会破坏胶原蛋白的结构，提高了制备的胶原蛋白的生物活性；鲻鱼鱼鳞的酶解：按照料液比1g:15～20mL向胶原蛋白中加入超纯水，用盐酸调溶液pH到2.0～2.5，按照胶原蛋白质量的0.8%～1.2%向溶液中加入胃蛋白酶（酶活力≥1.6×105U/g），酶解3～5h后，将溶液升温至90℃～95℃，并于此温度保持10～15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到9～10，按照蛋白质量的1.0%～1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶（2.0×105U/g），45～55℃酶解3～4h，得酶解产物，该条件下，酶的利用度高，单位酶产肽量大，产物的抑制效应小，大大提高了产品中铁螯合肽的提取率；鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备：将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用5～8倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3～5倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，该条件下，所获得的铁螯合肽纯度高，品质好，为铁螯合肽的应用研究提供了良好的条件。作为优选，凝胶柱层析过程为：将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物，该过程利用不同分子量大小的物质在层析柱中流动速度的不同实现了物质的分离，操作简单，且不影响产物的品质。作为优选，反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，其中，RP-HPLC条件为：进样量15～20μL，色谱柱为ZorbaxC18（250×4.6mm，5μm），流动相为40%甲醇，洗脱速度为0.8～1.0mL/min，紫外检测波长为220nm。该过程利用反向高效液相色谱制备出超高纯度的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术所公开鲻鱼鱼鳞铁螯合肽具有高的铁螯合活性，将其用于补铁保健品，可大大提高人体对铁离子的吸收；所公开的鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法条件温和，铁螯合肽的提取率高，纯度大，苦味和腥味小，生物活性好，使鲻鱼鱼鳞变废为宝，具有良好的社会经济效益；鲻鱼鱼鳞的酶解过程中酶的利用度高，单位酶产肽量大，产物的抑制效应小。附图说明图1是本专利技术的葡聚糖凝胶LH-20层析图；图2是葡聚糖凝胶LH-20制备酶解物的RP-HPLC分析；图3是本专利技术制备的铁螯合肽的ESI/MS检测。具体实施方式以下结合实施例和附图作进一步详细描述：实施例1：一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，包括以下步骤：1)鲻鱼鱼鳞的预处理：取鲻鱼鱼鳞，按照料液比1g:8mL向鲻鱼鱼鳞中加0.1mol/LNaOH溶液于4℃下浸泡6h，过滤，脱除非胶原蛋白，处理后鱼鳞用蒸馏水反复洗涤至pH为6.5，沥干，按照料液比1g:13mL加入0.5mol/LEDTA溶液（pH为7.4），于4℃下浸泡4天，每天更换1次EDTA溶液，脱除鱼鳞中的钙，干燥、粉碎，得脱钙鱼鳞；2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备：按照料液比1g:6mL向脱钙鱼鳞中加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡4d，12000g离心20min后取上清液，加入NaCl至溶液终浓度为0.9mol/L，静置75min，15000g离心18min得沉淀物，冷冻干燥即为鲻鱼鱼鳞胶原蛋白；3)鲻鱼鱼鳞的酶解：按照料液比1g:18mL向胶原蛋白中加入超纯水，用HCl调溶液pH到2.0，按照胶原蛋白质量的1.1%向溶液中加入胃蛋白酶（酶活力≥1.6×105U/g），酶解4h后，将溶液升温至90℃，并于此温度保持12min后，冷却至室温，用NaOH调溶液pH到9.5，按照蛋白质量的1.2%向溶液中加入碱性蛋白酶（2.0×105U/g），于温度48℃下酶解3.5h，得酶解产物；4)鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备：将制备的蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有9倍AB-8大孔树脂的层析柱中，用6倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用4倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇，经冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。其中，凝胶柱层析过程为：将上述胶原肽混合物溶于双蒸水配成浓度为20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物，如图1所示。反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化过程为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成50μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（所述RP-HPLC条件为：进样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，其特征在于：所述螯合肽氨基酸序列为：Gly‑Met‑Ala‑Gln‑Met‑Ala‑Gly‑Pro‑Pro‑Gly‑Glu，ESI/MS检测分子量为974.12Da。

【技术特征摘要】
1.一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽，其特征在于：所述螯合肽氨基酸序列为：Gly-Met-Ala-Gln-Met-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu，ESI/MS检测分子量为974.12Da。2.一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)鲻鱼鱼鳞的预处理：取鲻鱼鱼鳞，加入NaOH溶液脱除非胶原蛋白，再加入EDTA溶液，经浸泡、干燥得脱钙鱼鳞；2)鲻鱼鱼鳞胶原蛋白的制备：向脱钙鱼鳞中加入乙酸溶液并在4℃浸泡，分离得上清液，对上清液进行盐析，经分离得鲻鱼鱼鳞胶原蛋白；3)鲻鱼鱼鳞的酶解：向胶原蛋白中加入超纯水，用盐酸调溶液pH为2.0～2.5，加入胃蛋白酶酶解，将溶液升温至90℃～95℃，保持10～15min，冷却至室温，用NaOH调溶液pH为9～10，加入碱性蛋白酶酶解，得酶解产物；4)鲻鱼鱼鳞铁螯合胶原肽的制备：通过3kDa超滤膜对酶解产物进行超滤，收集分子量小于3kDa部分，经树脂层析柱纯化得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到鲻鱼鱼鳞铁螯合肽。3.根据权利要求2所述的一种鲻鱼鱼鳞铁螯合肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中乙酸溶液的浓度为0.5mol/L，乙醇溶液与脱钙鱼鳞的料液比为1g:5～8mL。4.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁迪，赵文浩，王斌，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33