长牡蛎干扰素调节因子CgIRF‑1基因重组蛋白、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开一种长牡蛎干扰素调节因子

【技术实现步骤摘要】
长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白、制备方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白、制备方法及应用。
技术介绍
长牡蛎是一种重要的海水养殖贝类。由于长牡蛎缺乏适应性免疫防御系统，主要依赖固有免疫系统抵御外源病原微生物的侵染，因此细菌、真菌和病毒引起的多种疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。干扰素（IFN）是一类能够抵抗病毒感染，抑制细胞周期和行使免疫调节功能的细胞因子。干扰素调节因子（IRFs）是调节干扰素（IFN）、干扰素刺激基因（ISG）以及其它相关基因表达的重要转录因子，能够与干扰素（IFN）或者干扰素刺激基因（ISG）上游启动子区含有5’-GAAA-3’保守基序的DNA序列相结合，并通过调节IFN、ISG和其它密切相关基因的表达而发挥多种生物学效应。在脊椎动物中，已经鉴定出了11个IRF，分别是IRF-1至IRF-11。所有的IRFs成员在其N端都含有一个保守的螺旋-转角-螺旋型的IRF结构域，又称为DNA锚定结构域。在这个结构域中含有5个保守的色氨酸残基（Trp），这5个保守的残基对识别含有5’-GAAA-3’四核苷酸的DNA序列具有重要作用。IRFs成员IRF-1和IRF-2的C端分别含有一个保守性很低的激活结构域和抑制结构域。研究发现，IRF-1与IRF-2不仅参与病毒防御，还在细胞增殖、分化、凋亡等细胞反应以及很多疾病的调节等发面发挥着重要作用。但是，迄今为止并没有关于长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白、制备方法及在制备免疫增强剂中应用的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白、制备方法及应用。本专利技术的技术解决方案是：一种长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种上述长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.用特定引物P1和P2对长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQIDNO.3所示；b.将PCR扩增产物与pET-30a载体经NdeI、XhoI酶切后通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；c.将上述重组子转入大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQIDNO.1中氨基酸序列的重组蛋白。一种上述长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白在制备免疫增强剂的应用。本专利技术的长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白能够在体外和IFN刺激反应元件（ISRE）结合，并且能够激活牡蛎中的类干扰素蛋白（IFNLP）的启动子，可作为免疫增强剂，在制备抗病毒类药物、抗癌剂及抗炎剂等方面具有应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白诱导和纯化的电泳图。图2为本专利技术实施例长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白与ISRE体外结合活性效果图。图3为本专利技术实施例长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白在HEK293T细胞中激活CgIFNLP启动子区的功能效果图。具体实施方式本专利技术的长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。上述长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白的制备方法，依次按照如下步骤进行：1.重组载体的构建用特定引物P1和P2对长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQIDNO.3所示；PCR反应条件为：首先95°C预变性5分钟，然后进入下列循环：95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸1min，共进行30个循环，最后72°C延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用Nde1和Xho1两个酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经Nde1和Xho1两个酶酶切的表达载体pET-30a连接，完成载体的构建。2.重组蛋白rCgIRF-1的表达以大肠杆菌BL21（(DE3）为重组表达菌株，将上述测序后读码框正确的重组载体转化到表达宿主菌中。挑取单克隆，接种于5ml含有卡那抗生素的LB液体培养基中，37°C摇床中震荡培养12~16h，然后以1：100的比例接种200mL含有卡那抗生素的LB液体培养基中，37°C，200rpm，培养至OD600＝0.5~0.7。加入IPTG，使终浓度达到1mMmL-1，130rpm，16°C继续培养4小时。4°C，10000rpm，离心10min，收集菌体，于-20°C冻存备用。取5mL菌液离心，弃去上清后，加入800μLTBS重悬，超声破碎后吸出上清备用，破碎后的沉淀加入80μLTBS（20mmolL-1Tris-HCl,150mmolL-1NaCl,pH8.0）彻底重悬。分别取20μL破碎后的菌液上清和重悬后的沉淀加入20μL2倍的蛋白上样缓冲液，100°C煮沸10min，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。3.重组蛋白rCgIRF-1的纯化采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化获得了可溶的重组蛋白rCgIRF-1，具体操作步骤如下：（1）镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10mL；（2）用缓冲液I，即TBS平衡2~5个床体积，流速为2mLmin-1；（3）经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000rpm，4°C离心30min，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mLmin-1；（4）用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2mLmin-1；（5）用有20mmolL-1咪唑的缓冲液I再洗2~5个柱床体积，流速为2mLmin-1；（6）用300mmolL-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集；（7）用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mLmin-1，柱子置于4°C环境中保存。非变性状态下提纯的重组蛋白需要在TBS缓冲液及纯水中分别透析3次除去咪唑。每次在4°C透析12h，即得到长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。长度：329个氨基酸类型：氨基酸链型：单链特性：分子量为38.383kDa，等电点为5.67，具有一个保守的IRF结构域即DNA锚定结构域。本专利技术实施例长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白诱导和纯化的电泳如图1所示。图1中泳道M：蛋白marker；1：未诱导的重组蛋白rCgIRF-1菌液；2：重组蛋白rCgIRF-1菌液诱导后破碎沉淀；3：重组蛋白rCgIRF-1菌液诱导后破碎上清；4：纯化后的重组蛋白rCgIRF-1。实验例1：本专利技术的长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白与ISRE的体外结合活性检测具体步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长牡蛎干扰素调节因子

【技术特征摘要】
1.一种长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种如权利要求1所述长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.用特定引物P1和P2对长牡蛎干扰素调节因子CgIRF-1基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQIDNO.2所示，所述引物P2的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，鹿蒙蒙，杨传燕，王玲玲，宋小瑞，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21