九子连环草甘露糖结合蛋白制造技术

本发明专利技术主要采用同源克隆和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术，获得九子连环草甘露糖结合蛋白的cDNA全长序列和氨基酸序列，其序列分别如序列表SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2所示。采用本发明专利技术，可以快速有效地扩增得到九子连环草甘露糖结合蛋白基因全序列，有助于该植物及其同家族的甘露糖结合蛋白的分子生物学研究，也为其更加广泛的应用提供了有力支持。

【技术实现步骤摘要】
九子连环草甘露糖结合蛋白
本专利技术涉及分子生物学基因工程
，具体涉及一种编码九子连环草甘露糖结合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。
技术介绍
九子连环草，CalanthediscolorLindl.，属于兰科植物，是一种传统的中草药，性温，味甘辛，无毒。可用以散结，解毒，活血，舒筋。九子连环草作为一种常用中药材，所含甘露糖结合蛋白丰度很低，但其凝血活性很强。单子叶甘露糖结合蛋白家族，是植物蛋白里的一个十分重要的家族分支，其组成成员十分庞大。这一家族的蛋白具有专一特异性结合甘露糖或甘露寡糖的能力，并且广泛分布于单子叶植物中，同时还具有多种十分有价值的生物学活性，如抗真菌活性及抗虫活性等。VanDamme,BalzariniJ,Smeets等人先后从兰科植物火烧兰和二叶兰的块茎中分离出两种以单体形式存在的抗真菌甘露糖结合蛋白(EHMBP和LOMBP)。目前，还没有关于编码兰科植物九子连环草甘露糖结合蛋白的基因全序列报道。
技术实现思路
鉴于上述不足之处，本专利技术的目的在于提供一种编码九子连环草甘露糖结合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。本专利技术所述九子连环草甘露糖结合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。本专利技术所述九子连环草甘露糖结合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。本专利技术通过从九子连环草新鲜嫩叶组织中提取的RNA，利用同源克隆和RACE(rapidamplificationofcDNAends)技术，快速克隆编码九子连环草甘露糖结合蛋白的基因。本专利技术具有以下有益效果：使用本专利技术所述技术方法和引物能够快速准确地获得一种兰科植物九子连环草甘露糖结合蛋白的基因全长序列及氨基酸序列。丰富了植物甘露糖结合蛋白家族成员信息，为后续应用和研究提供技术支持。附图说明图1是提取的九子连环草嫩叶组织的总RNA电泳图谱，图2是对九子连环草甘露糖结合蛋白基因进行3’RACE克隆片段的电泳图谱，其中A图是第一轮扩增的PCR产物；B图是第二轮扩增的PCR产物。图3是对九子连环草甘露糖结合蛋白基因进行5’RACE克隆片段的电泳图谱。图4是九子连环草甘露糖结合蛋白的核苷酸序列(cDNA全长)的电泳图谱。具体实施方式1.材料和方法1.1材料植物材料：九子连环草新鲜嫩叶组织：直接剪取。菌株：所用克隆菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli(Migula)CastellanietChalmers)Top10。质粒：pEASY-T1CloningVector，大小为3928bp，具有氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kal)两种筛选标记，便于重组子的筛选，具有带游离T的5’-黏性末端，为PCR产物的专用克隆载体(购买于北京全式金生物技术有限公司)。试剂盒和酶：Trizol试剂购买自Invitrogen公司；小量胶回收试剂盒购于Axygen公司。T4DNALigase、M-MLV反转录酶、TdT(核苷酸末端转移酶)、RibonucleaseInhibitor、EasyTaqDNAPolymerase、EasyPfuDNAPolymerase及Fermentas限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ均购自北京全式金生物技术有限公司。其余化学药品均为分析纯试剂。1.2方法1.2.1九子连环草总RNA的提取九子连环草总RNA的提取过程参照InvitrogenTrizol试剂盒的说明，如下：(1)取0.1mg左右新鲜的或-80℃低温保存的九子连环草嫩叶组织迅速置于充满液氮的研钵中，将组织充分研磨成粉末状；(2)用药匙将粉末分装到两个液氮预冷过的1.5mL离心管中，并向其中加入1mL的Trizol试剂，充分震荡混匀，置于冰上约5min；(3)向管中加入200μl氯仿，充分混匀后放置5min，然后在4℃，12，000g离心5min；(4)将上层水相转移到新的已预冷过的离心管中，加入500μl异戊醇，充分混匀后放置5min，然后在4℃，12，000g离心5min；(5)倒掉上清，加入75％乙醇将沉淀悬起，4℃，7，500g离心3min；(6)重复步骤5；(7)尽量将上清倒净，将离心管置于通风处风干约10min，使残留乙醇挥发干净；(8)向管中加入20-25μlRNAasefree的DEPC处理过的水(DEPC水)，通过1％琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。1.2.2非特异性简并引物的设计分析已知的兰科单子叶植甘露糖结合蛋白序列(所用序列均来自NCBIGenBankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，根据保守区域结合PCR引物设计原理,设计简并引物用于九子连环草甘露糖结合蛋白的基因克隆。正向引物(forwardprimer)(FP)：5’-GACTGC/TAAC/TCTCGTC/GCTC/G-3’；反转录引物(TP1)：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT(18)-3’；反向引物(reverseprimer)(TP2)：5’-GTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；反向引物(reverseprimer)(TP3)：5’-TACGTAACGGCATGACAGTG-3’。1.2.3mRNA反转录成cDNAmRNA的反转录操作如下(参照TakaRaM-MLV的说明书)：(1)取0.5mL离心管中加入如下成分：(2)上面的混合物置于70℃10min，使RNA变性；随后迅速置于冰上2min；短暂离心收集混合液体至管底，并继续向其中加入以下成分，步骤(1)(2)的总体积是20μl：(3)轻弹管底使液体混匀，然后短暂离心将液体收集至管底，置于42℃保温1min；(4)96℃高温5min使反转录酶失活从而中止反应；(5)经短暂离心收集反应物置于冰上，可储存在-20℃。1.2.4第一轮PCR扩增反应按以下反应体系添加PCR反应液：按以下条件进行PCR反应：将PCR反应混合液先经94℃，热变性5min，再扩增(94℃，30s；53℃，30s；72℃，45s；进行35个循环)，再于72℃下10min。反应在GeneAmpPCRSystem2400热循环仪(Promega公司，北京)上进行。1.2.5第二轮PCR反应第二轮PCR反应以本实施例1.2.4中所述的第一轮PCR反应产物为模板，将第一轮PCR产物用蒸馏水稀释10倍，用本实施例1.2.2中的所述引物TP3代替引物TP2，再次按本实施例1.2.4中反应体系配制PCR反应液进行PCR扩增。1.2.61％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物具体操作为：称取1g的琼脂糖于一个250mL的三角瓶中，另外量取100mLTE缓冲液(10mMTris-HCl，pH＝8.0，1mMEDTA)于三角瓶中，在微波炉中加热使其充分溶解至均匀透明状，置于室温下稍微降温后，取50μl的溴化乙锭(EB)加入其中，摇匀后即可倒胶。待胶凝固之后，将样品(PCR产物、RNA等)加入点样孔，打开电泳槽的电源，使样品在适当电压下顺电流方向泳动，电泳结束后在紫外成像仪中观察，结果如图2示。1.2.7PCR扩增产物的回收(参照Axygen柱式小量胶回收试剂盒说明书)(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，并置于已称好重量的1.5mL离心管中，再次称重算出胶块的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种九子连环草甘露糖结合蛋白，其特征在于，它具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种九子连环草甘露糖结合蛋白，其特征在于，它具有序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。2.一种九子连环草甘露糖结合蛋白，其特征在于，它具有序列表中SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍锦库，吴传芳，梁丹凤，龙鑫，袁媛，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51