一种禽腺病毒亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种禽腺病毒亚单位疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，所用的抗原为灭活的禽腺病毒Hexon蛋白，其中禽腺病毒Hexon蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术所提供的疫苗，其中所使用的Hexon蛋白为一个新型的Hexon蛋白，利用该Hexon蛋白制备的禽腺病毒亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，对禽腺病毒具有显著的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】
一种禽腺病毒亚单位疫苗
本专利技术属于疫苗制备
，具体涉及一种禽腺病毒亚单位疫苗。
技术介绍
禽腺病毒(FowlAdenoviridae，FAV)是一种病原多样的病原体，可引起人和动物等多种疾病。许多腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但有其它一些因素，特别是并发感染时，腺病毒可成为条件性病原，从而影响禽类宿主的健康。禽腺病毒感染鸡可呈明显症状或不具有明显症状。与该病毒有关的主要临床和病理症候群包括肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量减少。研究表明禽腺病毒的病毒粒外形呈立体对称的二十面体，直径70～90纳米，无包膜，外层由252个壳粒组成衣壳腺病毒结构(图1)。其中240个壳粒是六邻体(Hexon蛋白)，既具有共同的群特异性抗原，也具有型特异性抗原。另12个壳粒称五邻体，位于病毒粒的12个顶端，具有弱的群特异性抗原和一种使受感染细胞发生早期病变的毒性物质。而Hexon蛋白是禽腺病毒主要结构蛋白，带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，与保护性免疫反应有关。禽腺病毒Hexon在病毒颗粒表面处于易接近的位置。己对Hexon蛋白的结构和功能进行了广泛的研究。Hexon蛋白是大于900个残基的复杂蛋白。三聚体的分子包括两个非常保守的基座区P1和P2和四个高变环loop1、loop2、loop3、loop4。Loop1-Loop3所对应的氨基酸残基存在7个独特的超变区HVRs，这些HVRs在不同血清型之间的长度不同，变化范围再2-38个氨基酸之间。这些HVRs会导致Hexon蛋白的抗原性发生或多或少的变异。现有的禽腺病毒疫苗是使用完整的病原体作为制苗用抗原，但目前制造疫苗使用的毒株与临床流行毒株的抗原性存在较大差异，从而影响了攻毒保护效果，制约灭活疫苗的应用。弱毒疫苗的另一个问题是可能出现毒力返强的问题，存在接种疫苗后发病的情况，生物安全不能完全保证。而且，I群禽腺病毒作为原发病原的作用尚不清楚。有迹象表明，不同血清型，甚至相同血清型的不同毒株，其致病力和感染力差异很大。当通过自然途径或直接接触感染时，很多分离物都不能引起临床疾病的发生，仅以隐性感染的方式存在。但是鸡群感染FAV-I后，能够引起免疫抑制，造成机体对疫苗的免疫应答失败，给肉鸡养殖业带来严重的危害。使用全病毒抗原制备的传统疫苗免疫后产生的抗体，在临床上无法区分野毒感染或是疫苗免疫产生，干扰疫情的监测。这是目前传统疫苗存在的不足。为解决传统疫苗的问题，就需要筛选新的毒株或者开发新的亚单位疫苗以克服现有疫苗的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种禽腺病毒亚单位疫苗，是在筛选获得了一种新型的禽腺病毒Hexon蛋白的基础上提供的亚单位疫苗。本专利技术所提供的亚单位疫苗，是以禽腺病毒Hexon蛋白作为抗原制备的；其中禽腺病毒Hexon蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白，2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白；编码上述禽腺病毒Hexon蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:2；亚单位疫苗中的禽腺病毒Hexon蛋白经过甲醛溶液灭活；所述的亚单位疫苗中，禽腺病毒Hexon蛋白的含量不低于1000μg/ml。本专利技术所提供的疫苗，其中所使用的Hexon蛋白为一个新型的Hexon蛋白，利用该Hexon蛋白制备的禽腺病毒亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，对禽腺病毒具有显著的免疫效果。附图说明图1：禽腺病毒的结构图，图2：Hexon蛋白扩增图，其中m为DNAladdermarker，1-3为扩增的平行样品；图3：Hexon蛋白重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定图；其中M为预染蛋白标记；1为宿主菌自身表达蛋白；2为重组宿主菌表达Hexon蛋白。具体实施方式DNA疫苗是将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。该疫苗既具有减毒疫苗的优点，同时又无逆转的危险，因此越来越受到人们的重视，被看做是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。但制备亚单位疫苗，其基础就是筛选获得新型的抗原基因。申请人在筛选获得了一种发生变异的禽腺病毒的基础上，通过研究其抗原蛋白，从而促成了本专利技术。下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细的说明。实施例1：病毒的筛选及Hexon基因的扩增2015年在山东某已经注射过禽腺病毒疫苗的养鸡场的鸡群中出现了典型的Ⅰ群禽腺病毒导致的病症，对病鸡剖检可见主要病变为肝炎，肝色浅质脆，肿大，肝和骨骼肌有出血斑点。在肝细胞中有大而圆或不规则形的嗜酸性或嗜碱性核内包涵体。为了确定是否致病的禽腺病毒发生了突变，从发病死鸡肝脏进行病毒分离；然后扩增Hexon蛋白基因。具体步骤如下：1、病毒尿囊液的分离取病鸡的病变肝脏组织，研碎后用灭菌生理盐水制成悬液，然后在4000rpm/min离心30min，在离心的上清液中加入链霉素和青霉素各15000IU/ml，经0.22μm滤膜过滤后，滤液以0.1ml/鸡胚的剂量，经尿囊绒毛膜接种9-11日龄的SPF鸡胚，取接种48h-72h未死亡的鸡胚放于4℃冰箱保存5h后收取尿囊液。在盲传3代后，收取第三代的尿囊液。其中就包含有所要分离的病毒。2、分离病毒核酸1)取2.5ml保存的尿囊液冻融后，4℃下8000rpm离心20min，取上清液备用；2)在上清液中加入添加了1％SDS的蛋白酶K消化液进行消化，56℃水浴消化3h；3)加入等体积的苯酚，充分混均后，12000rpm离心10min；4)取上清加等体积的酚：氯仿抽提，至中间层无蛋白；上清液再用等量的氯仿抽提，12000rpm离心10min；5)取上清，加入预冷的1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20℃静置1h，然后12000rpm离心15min；6)将离心的沉淀用75％浓度乙醇溶液进行清洗，再12000rpm离心15min；弃上清，沉淀通风干燥，再加入20μl的TE溶液溶解，-20℃保存备用。3Hexon基因的扩增根据NCBI中发表的Hexon基因序列，设计并合成了引物,其中上游引物的序列信息如下：上游引物：5′-TTAGCTCACCGGTTGTCT-3′，下游引物的信息如下：5′-TTACACAGCGTTGCCT-3′。提取分离的病毒的核酸作为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增目的片段(图2)。片段回收后进行测序，扩增的基因,其编码区的核苷酸序列如下(SEQIDNO:1)：atgactgcgcttactcccgacctgaccacggcgacgccgcggctgcagtactttcatatcgcgggccctggcacccgagagtatctatccgaggatctccagcagttttcgtacctgtcccacacgatcgccgggacgagctactttgacttgaaaaacaaattcaggcagacggtcgtagctcccactcgcaatgtcaccaccaaggaagcacaccgcctgcagatcagattctacccgatccagacagatgacccagacaacagctatcg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗是以禽腺病毒Hexon蛋白作为抗原制备的；其中禽腺病毒Hexon蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白，2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗是以禽腺病毒Hexon蛋白作为抗原制备的；其中禽腺病毒Hexon蛋白，包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白，2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。2.如权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒Hexon蛋白，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙翠言，李军，张颖，王海东，
申请(专利权)人：青岛宏昊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37