一种肽核酸介导的蛋白精准自组装方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种肽核酸介导的蛋白精准自组装方法。通过多肽序列将目标蛋白上标记一段特异的PNA序列，并通过PNA与DNA模板高效、精准的结合，促成了多个目标蛋白的精准组装。

【技术实现步骤摘要】
一种肽核酸介导的蛋白精准自组装方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种肽核酸介导的蛋白精准自组装方法。
技术介绍
肽核酸(Peptidenucleicacid,PNA)作为组装模板。肽核酸是由Nielsen等人于1991年专利技术的类似于DNA和RNA的人工合成高分子聚合物(Nielsen,P.E.；Egholm,M.；Berg,R.H.；Buchardt,O.Science1991,254,1497-1500)。它主要存在以下特点：(1)超强结合力。肽核酸可以跟DNA(或RNA)在Watson-Crick氢键以及Hoogsteen氢键的驱动下形成很好的碱基配对相互作用。此外，由于PNA/DNA之间的碱基错配比DNA/DNA之间的更加不稳定，再加上PNA电中性的特点无法与互补的DNA链之间产生电荷排斥作用，因此PNA与DNA(或RNA)之间的结合能力要强于DNA(或RNA)本身。(2)超强稳定性。由于人工合成的主链骨架结构无法被体内的各种蛋白水解酶以及和酸水解酶所识别，因此无论是PNA本身，还是PNA参与结合的任何双链结构都不会被微生物体内的酶所降解。目前针对蛋白的自组装主要基于以下平台：(1)骨架蛋白。利用蛋白-蛋白间的相互作用，通过构建融合骨架蛋白的方法，使目标蛋白在骨架蛋白存在的情况下进行组装。但该方法存在相互作用较差、无法较好地控制蛋白间的比例以及骨架蛋白分子量太大等弊端；(2)纳米粒子。利用蛋白-纳米粒子间的相互作用，是目标蛋白在纳米粒子表面进行自组装。但是该方法存在无法精确控制蛋白间的比例、无法控制蛋白组装时的构型、潜在生物毒性等弊端；(3)dsDNA分子。利用蛋白-dsDNA间的相互作用，使目标蛋白在dsDNA上形成自组装。该方法存在选择性低、无法控制组装比例、无法实现精确自组装等弊端。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为了克服蛋白在自组装时无法精确控制、特异性差等问题，限制其在多酶体系、生物传感器、蛋白结构调控等生物领域中的普及使用。为解决上述问题，本专利技术提供一种肽核酸介导的蛋白精准自组装方法：(1)制备含活性多肽标签的融合蛋白，具体为，在蛋白的N端或C端融合了长度为21个天然氨基酸的多肽序列；(2)制备含靶向PNA序列的非天然多肽探针，具体为，在N端或C端连有长度为10个碱基PNA序列的非天然多肽(多肽长度为21个氨基酸)；(3)将步骤(1)中得到的含活性多肽标签的融合蛋白与步骤(2)中得到的含靶向PNA序列的非天然多肽探针进行共价键结合，这里的共价键结合具体是指的：融合蛋白上的半胱氨酸与多肽探针上的非天然X氨基酸间的共价键结合，常规多肽之间形成共价键时可能是识别某一位点，换言之标记位点是随机的，结合能力不强，而本专利中识别位点仅为融合蛋白上的21个氨基酸中固定的半胱氨酸，具有相当高的反应识别特异性；(4)将步骤(3)共价键结合的产物在ssDNA序列上进行可控自组装，ssDNA序列是指包含一段连接臂的长度为26个碱基的单链DNA序列，其作为结合模板。本专利技术提供的蛋白精准自组装的方式合成简单，组装精准，特异性高，生物兼容性好。通过多肽序列将目标蛋白上标记一段特异的PNA序列，并通过PNA与DNA模板高效、精准的结合，促成了多个目标蛋白的精准组装，从而为多酶体系、生物传感器等生物
提供了普适的组装平台。附图说明图1是含有PNA序列的非天然多肽(PNA-P1)的HPLC表征图。图2是含有PNA序列的非天然多肽(PNA-P2)的HPLC表征图。图3是含有活性多肽标签的融合蛋白(EGFP-CCE)与PNA-P1以及PNA-P2反应后的SDS-PAGE表征图。其中第一泳道为蛋白Marker，第二泳道为天然的EGFP-CCE，第三泳道为EGFP-CCE与PNA-P1共价结合后的复合物EGFP-PNA1，第四泳道为EGFP-CCE与PNA-P2共价结合后的复合物EGFP-PNA2。图4是含有活性多肽标签的融合蛋白(mCherry-CCE与PNA-P2)反应后的SDS-PAGE表征图。其中第一泳道为蛋白Marker，第二泳道为天然的mCherry-CCE，第三泳道为Cherry-CCE与PNA-P2共价结合后的复合物mCherry-PNA2。图5是EGFP-PNA1与ssDNA模板在不同化学计量数下的自组装效果图。随着蛋白量/模板量的增加，产物转化为两个EGFP-P1组装后的复合物。图6是EGPF-PNA1与ssDNA模板在不同化学计量数下自组装的机理图。随着蛋白量/模板量的增加，预测了不同产物的存在形式。图7是EGFP-PNA1和mCherry-PNA2在ssDNA模板的作用下形成1:1精准自组装的效果图。图8是本专利中，肽核酸介导的蛋白精准自组装的结合机理，其中(1)含活性多肽标签的融合蛋白、(2)含靶向PNA序列的非天然多肽探针、(3)融合蛋白上的活性多肽标签与非天然多肽的共价键结合、(4)ssDNA序列。具体实施方式实施例1载体构建：(1)将两段单链DNA序列5’-CAAATCTGAAGAGTC-TTATGAATGTGCTGCCTTAGAGAAGGAAGTTGCAGCGTTAGAGAAGGAAGTTGCTGCATTAGAGAAGTAGA-3’和5’-AGCTTCTACTTCTCTAATGCAGCAACTTCCTTC-TCTAACGCTGCAACTTCCTTCTCTAAGGCAGCACATTCATAAGACTCTTCAGATTTGAGCT-3’进行褪火，并使用PCR纯化试剂盒进行产物纯化；(2)将pET28m-EGFP与pET28m-mCherry质粒使用SacI和HindIII进行双酶切，并利用DNA胶回收试剂盒对电泳产物进行回收；(3)将上述(1)和(2)的产物混合，在T4DNA连接酶作用下进行酶连反应；(4)将(3)的产物进行转化、克隆筛选及测序获得质粒pET28m-EGFP-CCE及pET28m-mCherry-CCE。蛋白表达及纯化：(1)将上述构建的质粒pET28m-EGFP-CCE及pET28m-mCherry-CCE转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，并挑单克隆至5mLLB培养基中过夜培养；(2)将(1)中产物转移至500mLLB溶液中并在37度培养，待OD600到达0.6-0.8时使用IPTG进行诱导，随后16度培养过夜；(3)将(2)中产物离心收集，并使用超声破壁，再次离心后将蛋白上清液与Ni-NTA纯化柱孵育，并使用咪唑溶液进行梯度洗脱；(4)将(3)中产物进行SDS-PAGE分析，收集目标蛋白并进行溶液置换，得到产物EGFP-CCE以及mCherry-CCE(如附图3，4)。实施例2本专利技术所述的方法采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸(或肽核酸)去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸(或肽核酸)的羧基形成肽键，从而将氨基酸(或肽核酸)连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸：树脂与连接分子：固相Fmoc法选择的树脂为Rink树脂。这种树脂具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上；单体：合成所用单体为经化学修饰的α本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肽核酸介导的蛋白精准自组装方法，其特征在于：所述的方法为，(1)制备含活性多肽标签的融合蛋白；(2)制备含靶向PNA序列的非天然多肽探针；(3)将步骤(1)中得到的含活性多肽标签的融合蛋白与步骤(2)中得到的含靶向PNA序列的非天然多肽探针进行共价键结合；(4)将步骤(3)共价键结合的产物在ssDNA序列上进行可控自组装。

【技术特征摘要】
1.一种肽核酸介导的蛋白精准自组装方法，其特征在于：所述的方法为，(1)制备含活性多肽标签的融合蛋白；(2)制备含靶向PNA序列的非天然多肽探针；(3)将步骤(1)中得到的含活性多肽标签的融合蛋白与步骤(2)中得到的含靶向PNA序列的非天然多肽探针进行共价键结合；(4)将步骤(3)共价键结合的产物在ssDNA序列上进行可控自组装。2.如权利要求1所述的肽核酸介导的蛋白精准自组装方法，其特征在于：步骤(1)中，在蛋白的N端或C端...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建浩，王建鹏，邱琳，蒋鹏举，柳丽，刘晓骞，朱志兰，马路平，郭倩倩，杜炫呈，王政，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32