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一种提高水稻抗旱能力的烟曲霉的抗氧化产物的分离鉴定及其应用制造技术

技术编号:17767234 阅读:60 留言:0更新日期:2018-04-21 21:00
本发明专利技术公开了一种烟曲霉的抗氧化产物的分离鉴定及其在提高水稻抗干旱能力上的应用。该烟曲霉保藏名称为

【技术实现步骤摘要】
一种提高水稻抗旱能力的烟曲霉的抗氧化产物的分离鉴定及其应用
本专利技术涉及一种内生烟曲霉次级代谢产物的分离纯化方法及其应用,经过紫外(UV)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)测试确定结构,实验证明其可以降低干旱水稻的Pro、MDA含量,并通过调节SOD、POD、HSP70和NADPH氧化酶的途径来协助水稻抵抗干旱胁迫。
技术介绍
水稻(Oryzasativa)原产亚洲热带,在中国广为栽种后,逐渐传播到世界各地。世界上近一半人口,都以大米为食,故水稻的种植与生产对国计民生有重要影响。烟曲霉属于半知菌类真菌,本菌主要存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中,或寄藏于种子上,能引起人、畜和禽类的肺曲霉病及其他疾病,可侵染棉铃和苹果等,引起果实腐烂。本菌能产生烟曲棒麦角素(fumigaclavines)、烟曲霉震颤素(fumitremorgins),烟曲霉素(fumigillin)、烟曲霉毒素(fumitoxins)、疣孢青霉原(verruculogen)等多种次生代谢产物,但关于烟曲霉对植物的促生作用,目前国内外还鲜有报道。NFA可用作一种新抗生素,能选择性地抗结核分枝杆菌,也具有对由花生四烯酸及胶原刺激的兔血小板聚集的抑制活性,IC50值依次是2.25、6.00tag/mL,通过单次腹膜内剂量的该物质可以降低小鼠由花生四烯酸诱导的死亡率,并其可由酪氨酸和通过四氢叶酸代谢途径生成的甘氨酸生物合成,且其对大肠杆菌显示了拮抗作用,同时显示出针对Du145、A-549和HeLa细胞系的中等细胞毒性。本专利技术从一株烟曲霉SG-17产物中分离纯化得到具有抗氧化活性的物质NFA,它能通过调节Pro、MDA、SOD、POD、HSP70和NADPH氧化酶的含量来协助水稻抵抗干旱胁迫。可服务于开发新型抗氧化剂和水稻的种植与生产。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供具抗氧化活性物质NFA的分离纯化过程和制备条件,及其分子结构,服务于开发新型抗氧化剂。一种烟曲霉的抗氧化产物,该抗氧化产物为(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺。本专利技术NFA在分离鉴定过程中,室温下1天后会出现渐变的现象,产生其异构体(E)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺(ENFA)。薄层层析(TLC)分离NFA时,ENFA出现在NFA的下方。所述的烟曲霉的抗氧化产物,所述的烟曲霉保藏名称为AspergillusfumigatusSG17;保藏单位:中国典型培养物保藏中心;保藏地址为中国,武汉,武汉大学;保藏日期:2015年5月17日;保藏编号为,M2015286。本专利技术该提供一种用于提高水稻抗干旱胁迫的改良剂,该改良剂为(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺。所述的水稻生物改良剂,该改良剂含有抗氧化产物为(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺,该抗氧化剂的使用浓度为:0.05-0.2mg/mL,进一步优选为0.1mg/mL。所述的抗氧化产物(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺的分离方法,包括如下步骤:(1)菌株活化及发酵培养:将内生真菌烟曲霉SG-17接种在PDA固体培养基上,等生长到表型单一菌落时,挑取孢子放在SDA液体发酵培养基培养14d,得到内生真菌发酵菌悬液;(2)发酵液酯相初提物的制取:将内生真菌发酵菌悬液真空抽滤分离,得到菌体与滤液;乙酸乙酯萃取滤液得到发酵液乙酸乙酯相,发酵液乙酸乙酯相旋蒸至粘稠状,收集待用,为发酵液酯相初提物;(3)TLC分离发酵液酯相初提物:以石油醚与丙酮以体积比1:1-2条件下分离发酵液酯相初提物后,得到分离样品;分离样品分离的片段为多段时,采用T-AOC法和DPPH自由基清除法测定多个片段的抗氧化活性,抗氧化活性高则进行高效液相色谱分析。(4)高效液相色谱分析:取分离样品用甲醇完全溶解,用微孔过滤器过滤,取滤液进行半制备HPLC分离、纯化,得到化合物NFA。色谱分离纯化条件:分析柱为CosmosilMS-IIRP-C18色谱柱5μm,250×10mm分析型,流动相:乙腈:水=60:40(V/V),流速:3.0mL/min,紫外检测波长:254nm;半制备HPLC分离NFA时,ENFA保留时间约为9.58-10.00min,NFA保留时间约为10.78-11.30min。胁迫试验表明,NFA可使干旱水稻的Pro、MDA含量显著降低,能有效地协助水稻抵抗干旱胁迫。本专利技术NFA具有调节水稻SOD、POD、HSP70和NADPH氧化酶能力,可使干旱状态下水稻的SOD、POD、HSP70和NADPH氧化酶含量升高,在提高水稻干旱能力方面有显著作用,为明确植物的抗氧化胁迫代谢途径及提高高等植物对氧化胁迫的抵抗性奠定基础。附图说明图1本专利技术的NFA和ENFA结构式。其中NFA(左)和ENFA(右)的结构式。图2本专利技术的NFA和ENFA分离的TLC图。图3本专利技术的NFA和ENFA的HPLC图。图4本专利技术的NFA作用于干旱胁迫水稻的效果图。图5本专利技术的NFA对水稻干旱生理的影响。图6本专利技术的NFA对干旱逆境下水稻的氧化代谢的影响。具体实施方式实施例一:抗氧化活性物质NFA的分离纯化过程和制备条件,及其分子结构。菌株活化及发酵培养:将储存在冰箱内的内生真菌烟曲霉SG-17接种在PDA固体培养基上,在28℃环境中培养5d,等生长到表型单一菌落时,利用无菌接种针挑取孢子放在150mLSDA液体发酵培养基内(500mL锥形瓶),于28℃、120rmp培养14d。发酵液酯相粗提物的制取:将内生真菌发酵菌悬液通过真空抽滤装置过滤分离,得到菌体与滤液。用等量乙酸乙酯萃取滤液3次,将萃取液合并,得到发酵液乙酸乙酯相。发酵液乙酸乙酯相在42℃,0.1MPa下旋蒸至粘稠状,收集待用,为内生真菌发酵液酯相初提物。TLC分离SG-17发酵液酯相初提物:分离条件:石油醚:丙酮=1:1(体积比),分离SG-17发酵液酯相初提物后,得到4个分离片段(Fr.1-Fr.4)。利用T-AOC法和DPPH自由基清除法测定Fr.1-Fr.4的抗氧化活性,经测定,Fr.2的抗氧化能力最高,因此取该片段进行半制备HPLC制备。(结果如下)高效液相色谱(HPLC)分析Fr.2:取少量Fr.2样品并用少量甲醇完全溶解,用0.22μm有机系微孔过滤器过滤,取滤液进行半制备HPLC分离、纯化,得到化合物NFA。色谱分离纯化条件:分析柱为CosmosilMS-IIRP-C18色谱柱(5μm,250×10mm分析型),流动相:乙腈:水=60:40(V/V),流速:3.0mL/min,紫外检测波长:254nm。半制备HPLC分离NFA时,ENFA保留时间约为9.58-10.00min,NFA保留时间约为10.78-11.30min。NFA向ENFA的转化:室温下1天后NFA会出现渐变的现象,产生其异构体ENFA。TLC分离NFA时,ENFA出现在NFA的下方。NMR检测:将经HPLC分离、纯化后得到的单体化合物NFA用冷冻干燥仪冷冻干燥,用0.5mL氘代DMSO溶解NFA,将溶液装入核磁管,利用BrukerAVANCE400MHz核磁共振波谱仪测定NFA的氢谱和碳谱,具体如下:实施例二:NFA协助水稻抵抗干旱胁迫浓度的确定水稻幼苗制备:将从4℃冰箱中取出的日本晴种子置于自来水中浸泡4d,促使其本文档来自技高网
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一种提高水稻抗旱能力的烟曲霉的抗氧化产物的分离鉴定及其应用

【技术保护点】
一种烟曲霉的抗氧化产物,该抗氧化产物为(Z)‑N‑(4‑羟基苯乙烯基)甲酰胺。

【技术特征摘要】
1.一种烟曲霉的抗氧化产物,该抗氧化产物为(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺。2.权利要求1所述的烟曲霉的抗氧化产物,所述的烟曲霉保藏名称为AspergillusfumigatusSG17;保藏单位:中国典型培养物保藏中心;保藏地址为中国,武汉,武汉大学;保藏日期:2015年5月17日;保藏编号为,M2015286。3.一种用于提高水稻抗干旱胁迫的改良剂,该改良剂为(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺。4.一种水稻生物改良剂,该改良剂含有权利要求1的抗氧化产物为(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺,该抗氧化剂的使用浓度为0.05-0.2mg/mL。5.一种水稻生物改良剂,该改良剂含有权利要求1的抗氧化产物为(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺,该抗氧化剂的使用浓度为0.1mg/mL。6.权利要求1所述的抗氧化产物(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺的分离方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)菌株活化及发酵培养:将内生真菌烟曲霉SG-17接种在PDA固体培养基上,等生长到表型单一菌落时,挑取孢子放在SDA液体发酵培养基培养,得到内生真菌发酵菌悬液;(2)发酵液酯相初提物的制取:将内生真菌发酵菌悬液真空抽滤分离,得到菌体与滤液;乙酸乙酯萃取滤液...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘士平高媛秦王阁阁薛艳红
申请(专利权)人:三峡大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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