一种白及种子超低温保存方法技术

本发明专利技术提供了一种白及种子超低温保存方法，包括步骤以下：白及种子置入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育30～60min，再将其放入梯度降温盒中，一起放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；经低温保存8年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，过滤去除冻存液后用于种子发芽。本发明专利技术进行白及超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的白及种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后白及种子发芽率高达95％以上。

A method of cryopreservation of Rhizoma Bletillae seeds

The invention provides an ultra-low temperature preservation method for Rhizoma Bletillae seed, including the following steps: the Rhizoma Bletillae seed is placed in the cryopreservation tube, and then added to the freezing solution at room temperature for 30 ~ 60min, and then put into a gradient cooling box, and put together in a low temperature refrigerator to make the temperature of the cooling box at - 35 - to - 60 C, and the cooling rate of - 1. C /min, then take out the cooling box, immediately put the cooling box into liquid nitrogen, and keep the liquid nitrogen at low temperature and reserve. After 8 years of cryopreservation, the cooling box is taken from the liquid nitrogen and slowly thawing, and the filtrate is removed after the cryopreservation solution is used for seed germination. The invention has the advantages of simple technology and reliable stability. There is no significant difference between the germination rate of Rhizoma Bletillae seeds and the germination rate of fresh seeds after the preservation, and the germination test results show that the germination rate of Rhizoma Bletillae seeds is up to 95% after cryopreservation.

【技术实现步骤摘要】
一种白及种子超低温保存方法
本专利技术涉及一种白及种子超低温保存方法，属于药材种子资源保存

技术介绍
白及，又名白给、连及草、紫兰根，为兰科白及属多年生草本植物，株高18～60cm。白及主要分布于东亚地区，在我国零星分布于陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川、重庆、云南和贵州等省(市)。通常生长于海拔100～3200m的常绿阔叶林或针叶林，以路边草丛、岩石缝中较散见。白及地下块茎肥厚、肉质、富粘性，常为3枚(个别种类为5枚或是1枚)，它是白及苗每年新生长的呈扁球形或扁卵圆形的假鳞茎，着生有数量较多的细长根。每枚假鳞茎在发芽季节可长出新芽1个。毗邻假鳞茎相连，串成叉状的地下茎(块根)。白及真正的茎很短，4～6枚狭长形或披针形叶着生基部成鞘并抱茎；叶长8～29cm，宽1.5～4cm。白及花紫红色或粉红色、白色、黄色，供观赏。白及属全球共6种，我国有白及、黄花白及、小白及和华北白及分布。白及假鳞茎是常用中药，止血收敛、消肿生肌功效好。入药内服主治肺结核咯血、支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等症；外用治外伤出血、烧烫伤、手足皲裂等。近年来研究发现，白及假鳞茎中的白及胶是主要药效部位，其主要成分是葡甘聚糖等水溶性多糖。白及胶的理化性质与阿拉伯胶、西黄蓍胶类似，但黏性特殊。白及胶、白及生物碱，以及白及其他活性成分，在抑制肿瘤细胞增生、延缓皮肤衰老，以及增稠、悬浮、保湿、助乳化和赋型等方面具有广泛市场前景。在临床实践中，发现白及若配伍得当，可治疗多种疾病，造成市场对该药需求量大增，对白及种子需求也随之增加。常温保存中药材种子，需要每年重新繁种更新，因为植物种子经过常温保存，活力降低很快；低温保存植物种子，在中国，建立了国家中期库和国家种质库，国家中期库保存的温度为4℃左右，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5～10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18℃左右，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种植20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。因此，为了安全保存白及种质资源，研究探索一种安全而长久保存白及种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适合于白及种子的超低温保存法，该方法能够补充现在白及种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存白及种质资源，为白及种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。本专利技术的目的是提供一种白及种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育30～60min，再将其放入梯度降温盒中；(2)将带有白及种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃～-60℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；(3)经低温保存8年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，过滤去除冻存液后用于种子发芽。所述白及果荚为当年收获鲜种，自然晒干即可。在一个具体方案中，步骤(1)中所述抗冻液是指MS液体培养液，还包含有1.8～2.8mol/L甘油、1.4～2mol/L二甲基亚砜和0.5～0.9mol/L蔗糖。在一个具体方案中，步骤(1)中所述梯度降温盒中含有100％甘油或异丙醇，可以重复使用。所述抗冻液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。在一个具体方案中，步骤(2)中所述低温冰箱的温度要求一般在-70℃以下。白及上述所保存的白及种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中白及种子，再用自来水或者蒸馏水过滤洗涤3～5次，清洗后白及种子直接用于培养。技术效果1、本专利技术进行白及超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的白及种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后白及种子发芽率高达95％以上。2、本专利技术具有长期、有效、安全保存白及种子，是白及种质资源长期保存的最有效方法。具体实施方式下面，本专利技术将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。实施例1取某地当年收获的白及果荚，自然晒干，室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液(含有2.1mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜和0.7mol/L蔗糖的MS)，室温温育50min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存8年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中白及种子从液氧取出室温解冻，再用自来水或者蒸馏水滤纸过滤洗涤4次，清洗后白及种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到98.16％。对照实施例1取某地当年收获的白及果荚，自然晒干，室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液(含有2.1mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜的MS)，室温温育50min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存8年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中白及种子，再用自来水或者蒸馏水滤纸过滤洗涤4次，清洗后白及种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到73.73％。对照实施例2取某地当年收获的白及果荚，自然晒干，室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液(含有2.1mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜和0.7mol/L蔗糖的MS)，室温温育50min，再将其放入在-5℃左右低温冰箱保存8年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中白及种子，再用自来水或者蒸馏水滤纸过滤洗涤4次，清洗后白及种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到21.47％。而取新鲜白及1～5℃下低温保存6年后，用于发芽实验，经测试白及未能发芽。实施例2取某地当年收获的白及果荚，自然晒干，室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液(含有2.2mol/L甘油、1.8mol/L二甲基亚砜和0.8mol/L蔗糖的MS)，室温温育50min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存8年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中白及种子从液氧取出室温解冻，再用自来水或者蒸馏水滤纸过滤洗涤4次，清洗后白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白及种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育30～60min，再将其放入梯度降温盒中；(2)将带有白及种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；(3)经低温保存8年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，过滤去除冻存液后用于种子发芽。

【技术特征摘要】
1.一种白及种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将未损坏的白及果荚打开，用镊子使白及种子转入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育30～60min，再将其放入梯度降温盒中；(2)将带有白及种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；(3)经低温保存8年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，过滤去除冻存液后用于种子发芽。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：向华，唐忠海，唐克华，
申请(专利权)人：张家界本草科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43