一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法技术

技术编号:17749234 阅读:45 留言:0更新日期:2018-04-21 09:47
本发明专利技术公开一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,包括如下步骤:对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪;从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清,测定血清中的生化指标,判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响;取待测仔猪的肝脏样品,观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构,并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达,分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用。本发明专利技术提供的技术方案中,以脂多糖为诱导剂,以肝脏细胞作为细胞程序性坏死模型的模型细胞,并以仔猪作为建模对象,成功建立了肝脏细胞程序性坏死模型,操作方法简便易行;通过测定肝脏细胞程序性坏死的关键基因及蛋白表达,具有测定结果可靠且重复性好的优点。

Establishment of a lipopolysaccharide induced programmed necrosis model of liver cells in piglets

The invention discloses a method for the establishment of a lipopolysaccharide induced programmed necrosis model for piglet liver cells. The following steps are as follows: the piglets were treated with lipopolysaccharide, and the piglets were collected and the serum was isolated from the anterior vena cava of the piglets, and the biochemical indexes in the serum were measured, and the lipopolysaccharide was induced to be induced to piglets. The effects of liver function were observed, the morphological structure of liver tissue and the ultrastructure of liver cells were observed, and the key genes and protein expression of programmed necrosis of liver cells were measured, and the effect of lipopolysaccharide on the programmed necrosis of liver cells in piglets was analyzed. In the technical scheme, using lipopolysaccharide as the inducer, the liver cells are used as the model cells of the cell programmed necrosis model, and the piglet is used as the modeling object. The liver cell programmed necrosis model is successfully established. The operation method is simple and easy, and the key gene of the procedure necrosis of the liver cells is determined. Protein expression has the advantages of reliable and reproducible results.

【技术实现步骤摘要】
一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法
本专利技术涉及细胞程序性坏死研究
,特别涉及一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法。
技术介绍
细胞程序性坏死是一种由死亡受体介导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡模式,通常在凋亡被抑制的情况下发生,死亡细胞具有明显的坏死特征。研究表明,细胞程序性坏死在缺血再灌注和炎症反应等多种因素导致的组织(如肝脏)损伤或坏死中发挥重要作用,有效抑制细胞程序性坏死对这些因素诱导的组织损伤或坏死具有重要的预防和治疗作用。目前常用于诱导细胞程序性坏死的诱导剂包括融合蛋白、病毒转染系统和黍子籽粒蛋白,但是其中涉及复杂的诱导剂制备过程,包括构建载体、转染、诱导等许多步骤,以及涉及脱盐、阳离子交换层析和凝胶层析等繁琐步骤获得纯化蛋白的制备过程,因此,利用此类诱导剂构建细胞程序性坏死模型存在步骤繁琐的缺点。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,旨在成功建立肝脏细胞程序性坏死模型,且建立方法简单、效果稳定可靠。为实现上述目的,本专利技术提出一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,包括如下步骤:对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪;从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清,测定血清中的生化指标,判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响;取待测仔猪的肝脏样品,观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构,并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达,分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用。优选地,对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪的步骤中:所述脂多糖为大肠杆菌血清型脂多糖,纯度大于99%,诱导处理的方式为腹膜注射。优选地,所述大肠杆菌血清型脂多糖的注射量为仔猪每公斤体重注射80~150μg,诱导时长为2~24h。优选地,对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪的步骤之前,还包括:将试验仔猪饲养在饲养笼中,试验仔猪于22~25℃温度条件下自由采食饮水10天;其中,在对仔猪进行诱导处理前10~13h停止供料。优选地,所述试验仔猪为34~36日龄的断奶仔猪,体重为8.7~9.1kg。优选地,从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清,测定血清中的生化指标,判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响的步骤,具体包括:用促凝真空管从待测仔猪的前腔静脉采血,然后通过离心分离得到血清,利用生化分析仪测定血清中的生化指标,判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响;其中,生化指标包括血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶以及谷氨酰转肽酶的活性。优选地,取待测仔猪的肝脏样品,观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构,并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达,分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用的步骤,具体包括:对采血后的待测仔猪进行戊巴比妥钠肌肉注射,使待测仔猪完全麻醉后屠宰并取出肝脏;将肝脏放置于冰上,并用生理盐水冲掉肝脏上的血迹,然后切取肝脏样品,用于肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构观察,取部分剩余肝脏剪碎后,用于肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达的测定,根据观测结果分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用;其中,所述肝脏细胞程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1、受体相互作用蛋白3、混合系列蛋白激酶结构域样蛋白以及磷酸甘油酸变位酶5。本专利技术提供的技术方案中,以脂多糖为诱导剂,以肝脏细胞作为细胞程序性坏死模型的模型细胞,并以仔猪作为建模对象,成功建立了肝脏细胞程序性坏死模型,操作方法简便易行;通过测定肝脏细胞程序性坏死的关键基因及蛋白表达,具有测定结果可靠且重复性好的优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例2中对照组的肝脏组织的形态结构观察结果图;图2为本专利技术实施例2中处理组的肝脏组织的形态结构观察结果图;图3为本专利技术实施例3中对照组的肝细胞放大1700倍的超微结构观察结果图;图4为本专利技术实施例3中处理组的肝细胞放大1700倍的超微结构观察结果图;图5为本专利技术实施例3中处理组的肝细胞放大5000倍的超微结构观察结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术提出一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,所述脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法包括如下步骤:步骤S10、对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪;由于猪和人在体重、解剖及生理结构特征方面与人体极为相似,因此,以活体仔猪作为建模对象,使得通过本专利技术提供的方法建立的肝脏细胞程序性坏死模型,更便于研究人体肝脏细胞的程序性坏死,进而研究肝脏损伤机制,从而为人类肝脏疾病的预防及相关药物的研究起到重要作用。脂多糖(LPS)又称为内毒素,是革兰氏阴性菌细胞外膜的结构成分,于细菌菌体死亡破裂或人工方法裂解后释放或活跃繁殖时释放出来。LPS本身无毒性作用,但它进入微循环后,能刺激多种细胞合成释放炎性因子,如TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-1(白细胞介素1)和IL-6(白细胞介素6)等,引起全身炎症反应综合症、脓毒血症和感染性休克等疾病;LPS也会导致组织器官的损伤,如刺激肝脏枯否细胞分泌大量TNF-α,造成肝脏结构和功能损伤。在本专利技术技术方案中,以LPS为诱导剂来建立肝脏细胞程序性坏死模型,具有诱导剂来源简便(可直接购买)、成本低廉、建模时间短的特点。在具体实施时,步骤S10中:所述脂多糖为大肠杆菌血清型脂多糖,纯度大于99%,诱导处理的方式为腹膜注射。在本专利技术实施例中,对试验仔猪进行诱导处理的方法为腹膜注射,向试验仔猪注射一定量的脂多糖诱导剂(一定浓度)后,间隔一段时间后,获得待测仔猪,并对脂多糖诱导结果进行相关检测。在本专利技术技术方案中,所述诱导剂为大肠杆菌血清型脂多糖(大肠杆菌血清型O55:B5),纯度大于99%。其中,所述大肠杆菌血清型脂多糖的注射量为仔猪每公斤体重注射80~150μg,诱导时长为2~24h。所述脂多糖的注射量越大,对试验仔猪刺激诱导所需要的时间就越短,在本专利技术的一实施例中,具体操作可采用如下方法:向试验仔猪每千克腹膜注射100μg的LPS(大肠杆菌血清型O55:B5,纯度大于99%),诱导4h后,即可导致试验仔猪的肝脏细胞发生程序性坏死,从而成功建立仔猪肝脏细胞程序性坏死模型,具有模型构建时间短的优点。可选地,在步骤S10之前还包括:将试验仔猪饲养在饲养笼中,试验仔猪于22~25℃温度条件下自由采食饮水10天;其中,在对仔猪进行诱导处理前10~13h停止供料。其中,所述试验仔猪为34~36日龄的断奶仔猪,体重为8.7~9.1kg。具体实施过程为:选择体重为8.7~9.1kg、34~36日龄的杜洛克×长白×大白断奶仔猪,饲养在1.8×本文档来自技高网...
一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法

【技术保护点】
一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,其特征在于,包括如下步骤:对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪;从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清,测定血清中的生化指标,判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响;取待测仔猪的肝脏样品,观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构,并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达,分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用。

【技术特征摘要】
1.一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,其特征在于,包括如下步骤:对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪;从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清,测定血清中的生化指标,判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响;取待测仔猪的肝脏样品,观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构,并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达,分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用。2.如权利要求1所述的脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,其特征在于,对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪的步骤中:所述脂多糖为大肠杆菌血清型脂多糖,纯度大于99%,诱导处理的方式为腹膜注射。3.如权利要求2所述的脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,其特征在于,所述大肠杆菌血清型脂多糖的注射量为仔猪每公斤体重注射80~150μg,诱导时长为2~24h。4.如权利要求1所述的脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,其特征在于,对试验仔猪进行脂多糖诱导处理,得到待测仔猪的步骤之前,还包括:将试验仔猪饲养在饲养笼中,试验仔猪于22~25℃温度条件下自由采食饮水10天;其中,在对仔猪进行诱导处理前10~13h停止供料。5.如权利要求4所述的脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法,其特征在于,所述试验仔猪为34~36日龄的断奶...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘玉兰康萍汪龙梅朱惠玲王秀英
申请(专利权)人:武汉轻工大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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