迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法技术

本分案申请涉及迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法。本发明专利技术采用如下技术方案，迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法包括如下步骤：选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理，从热处理后的无菌试管苗上取茎尖进行初代培养丛生芽，在初代培养的基础上进行继代培养，将成活的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后进行生根培养。本发明专利技术采用组织培养技术进行苗木繁育，可以大大加快迷你蝴蝶兰的繁育速度。苗木质量高，由此提高观赏性：采用组织培养技术可以脱除迷你蝴蝶兰的主要病毒，消除了病毒的危害状，提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。

Tissue culture method of detoxified seedlings of mini Phalaenopsis

This case involves tissue culture of mini Phalaenopsis virus free plantlets. The invention adopts the following technical scheme. The tissue culture method of the mini Phalaenopsis detoxified seedling includes the following steps: selecting the mini Phalaenopsis aseptic test tube seedling for heat treatment, taking the stem tip from the aseptic test tube after the heat treatment to culture the first generation buds and subculture on the basis of the first generation culture, and will be alive and clustered. The virus was detected by buds, and then the virus negative cluster sprouts were selected for subculture. Finally, rooting culture was carried out. The invention uses tissue culture technology to breed seedlings, which can greatly accelerate the breeding speed of mini Phalaenopsis. The quality of the seedlings is high, thus improving the ornamentability: the use of tissue culture technology can remove the main virus of the mini Phalaenopsis, eliminate the damage of the virus, and improve the ornamental character of the mini Phalaenopsis.

【技术实现步骤摘要】
迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法本申请为申请号为2017107297756、申请日为2017年8月23日、专利技术名称为“迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法”的分案申请。
本专利技术属于生物
，具体涉及迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法。
技术介绍
迷你蝴蝶兰又称小花蝴蝶兰，是蝴蝶兰PhalaenopsisaphroditaRchb.F.的变种，通常指的是高度在20-25cm，可放置于2寸盆器中的蝴蝶兰。由于其体型小，方便包装，在国外经常被用作精致的礼品。由于迷你蝴蝶兰的栽培周期短，自组培瓶取出至可催梗阶段只需7-9个月，资金回收快，因此成为兰花产业入门者的首选。尽管通过有性繁殖的种子苗几乎不携带病毒，且具有植株生长速度快等优势，但是由于其植株高低不齐且花色不一，因此商品性状较差，生产数量逐年大幅度降低。而通过组织培养技术(无性繁殖)生产的分生苗，因其植株和花色高度一致，逐渐替代种子苗，目前已占据市场份额的90％以上。但长期的无性繁殖必然会导致病毒的积累，致使品种日益退化，品质下降。兰花病毒一直是严重危害蝴蝶兰品质的一类重要病害，其寄主范围广泛，易传染，防治困难。目前世界上已经报道的兰花病毒有25种，其中以建兰花叶病毒(Cymbidiummosaicvirus，CymMV)和齿兰环斑病毒(OdontoglossumRingSpotVirus，ORSV)发生最为普遍，危害也最严重。这两种病毒能使蝴蝶兰叶片形成褪绿条纹、凹陷灰白斑或坏死环斑，导致植株生长不良，花少、花期缩短，并且经常复合感染，危害加剧，使蝴蝶兰的观赏价值和经济价值大幅度下降。为避免蝴蝶兰病毒大规模发生，在亲本分生繁殖之前必须经过病毒检测，蝴蝶兰病毒也是苗木出口检疫的必检对象。为了提高蝴蝶兰瓶苗的竞争力，清除ORSV和CymMV以及更多的病毒，培育优质脱毒苗是蝴蝶兰生产发展的必然趋势。
技术实现思路
为弥补现有技术的不足，本专利技术提供一种迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法，该方法获得苗木质量高，脱出迷你蝴蝶兰的主要病毒，消除了病毒的危害状，提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。本专利技术采用如下技术方案，迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法包括如下步骤：选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理，从热处理后的无菌试管苗上取茎尖进行初代培养丛生芽，在初代培养的基础上进行继代培养，将成活的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后进行生根培养。其中，初代培养基中6-BA浓度为3.0-4.0mg/L、NAA浓度为0.3-0.5mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L；继代培养基中，6-BA浓度为7.0-9.0mg/L、NAA浓度为0.2-0.4mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L；生根培养基中6-BA浓度为3.5-4.5mg/L、NAA浓度为0.7-0.9mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L。优选的，所取迷你蝴蝶兰茎尖大小为0.5-1.0mm。优选的，初代培养基中还加入浓度为1-5/L的碳酸氢钠和浓度为20-40mg/L的病毒唑。优选的，所述初代培养的条件为：首先进行两周暗培养，然后于温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，培养四周。由于植物病毒是通过输导组织在植物体内进行传播的，而植物的分生组织由于分裂很快且还没有形成输导组织，因此分生组织内不存在病毒，本专利技术采取抑制和钝化病毒的热处理和化学试剂处理外植体，经过不同阶段的培养，通过分子水平上的病毒检测技术，最终可以获得脱除主要病毒的迷你蝴蝶兰苗木，使迷你蝴蝶兰在无主要病毒的情况下进行快速繁殖。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：由于采用组织培养技术进行苗木繁育，可以大大加快迷你蝴蝶兰的繁育速度。苗木质量高，由此提高观赏性：采用组织培养技术可以脱出迷你蝴蝶兰的主要病毒，消除了病毒的危害状，提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。附图说明图1为受蝴蝶兰病毒危害叶片图；其中，左图为褪绿条纹，右图为坏死环斑；图2为迷你蝴蝶兰CyMVRT-PCR产物电泳图；其中，泳道1，2，3，4代表检测结果为阳性，泳道5，6代表检测结果为阴性；431bp为CyMV特异扩增带；图3为迷你蝴蝶兰ORSVRT-PCR产物电泳图，其中，泳道1，2，3，4代表检测结果为阴性，泳道5，6，7，8代表检测结果为阳性；332bp为ORSV特异扩增带。具体实施方式下面通过附图和具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。实施例1取带毒的迷你蝴蝶兰无菌试管苗，将其置于变温光照培养箱中。开始处理时温度为30℃，每隔一天的延续期后增加1℃继续热处理培养迷你蝴蝶兰，利用逐步升高温度的方法使迷你蝴蝶兰适应热处理的温度条件，至温度上限38℃。到达38℃之后，继续培养4周，湿度保持80％左右，光照条件为每日16h，光照强度3000Lux。将热处理4周后仍健康的迷你蝴蝶兰无菌苗，在解剖镜下剥取茎尖生长点，茎尖大小为0.5mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L上，在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠，病毒唑使用的浓度为20mg/L，碳酸氢钠的使用浓度为1.0g/L。先进行两周的暗培养后，继续按培养条件：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，培养4周，将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA8.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L)上，将成活的丛生芽进行扩大化培养，培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养，所用生根培养基为1/2MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.8mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L，生根培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d。实施例2迷你蝴蝶兰处理同实施例1。在解剖镜下剥取茎尖生长点，茎尖大小为0.8mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA3.5mg/L+0.4mg/LNAA琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L上，在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠，病毒唑使用的浓度为30mg/L，碳酸氢钠的使用浓度为3.0g/L。先进行两周的暗培养后，继续按培养条件：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，培养4周，将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA7.0mg/L+NAA0.3mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L)上，将成活的丛生芽进行扩大化培养，培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养，所用生根培养基为1/2MS+6-BA4.5mg/L+NAA0.9mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L，生根培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d。实施例3迷你蝴蝶兰处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理，从热处理后的无菌试管苗上取大小为0.5‑1.0mm茎尖进行初代培养、继代培养，将成活的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后进行生根培养，其中，初代培养基中6‑BA浓度为3.0‑4.0mg/L、NAA浓度为0.3‑0.5mg/L、香蕉泥为25‑35g/L、活性炭为2‑4g/L；继代培养基中，6‑BA浓度为7.0‑9.0mg/L、NAA浓度为0.2‑0.4mg/L、香蕉泥为25‑35g/L、活性炭为2‑4g/L；生根培养基中6‑BA浓度为3.5‑4.5mg/L、NAA浓度为0.7‑0.9mg/L、香蕉泥为25‑35g/L、活性炭为2‑4g/L。

【技术特征摘要】
1.迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理，从热处理后的无菌试管苗上取大小为0.5-1.0mm茎尖进行初代培养、继代培养，将成活的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后进行生根培养，其中，初代培养基中6-BA浓度为3.0-4.0mg/L、NAA浓度为0.3-0.5mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L；继代培养基中，6-BA浓度为7.0-9.0mg/L、NAA浓度为0.2-0.4mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L；生根培养基中6-BA浓度为3.5-4.5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯义龙，郭银银，倪天泽，蔡军，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21