一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法技术

本发明专利技术涉及一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养；步骤（3），烟草外植体培养；步骤（4），防褐化培养。本发明专利技术添加D‑异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙在培养基中，D‑异抗坏血酸钠具有防褐化的作用，且成本较低，柠檬酸对于PPO的辅基铜离子有螯合作用，从而能有效抑制PPO的活性，来改善褐化现象。而氯化钙在一定浓度时能有效抑制酶活性的作用。同时添加这三种成分对缓解外植体褐化的现象，无需辅助其他防褐化手段。

A browning method for tobacco explants combined with multi substances

The invention relates to a multi material combination of tobacco explant anti browning method, which includes the following steps: step (1), seed disinfection; step (2), seed culture; step (3), tobacco explant culture; step (4), anti browning culture. The invention adds D sodium isoascorbate, citric acid and calcium chloride in the medium, and D sodium isoascorbate has the effect of anti browning, and the cost is low. Citric acid has a chelating effect on the cofactor copper ion of PPO, which can effectively inhibit the activity of PPO and improve the browning image. Calcium chloride can inhibit enzyme activity at a certain concentration. At the same time, adding these three ingredients to alleviate the phenomenon of explant browning did not need to assist other browning prevention methods.

【技术实现步骤摘要】
一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法
本专利技术涉及一种烟草外植体防褐化方法，具体是一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。
技术介绍
褐化是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化的发生是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，与培养材料组织中的蛋白质发生聚合引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。对于引起植物组织褐化的因素已有研究报道，引起组织培养中外植体褐化的主要因素是受植物的基因型、外植体影响、培养条件及培养基等影响。由于褐化对于外植体材料产生的毒害作用，将进一步影响植物材料的生长和分化，严重时导致死亡。尽管引起褐化现象的因素较多，但选择合适的外植体，筛选合适的培养基和培养条件能有效地防止褐化。烟草（Nicotianatabacum）是茄科烟草属植物，现主要分布在南美洲、南亚和中国等地区。它不仅是重要的经济作物，更是国家和地方财税的重要经济来源。烟草有多种用途，可用于医药等领域，有研究者在花烟草中发现一种能够杀死癌细胞的新蛋白质化合物。但是烟草在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，褐化会导致植株的死亡，也就是培养基中的植物不能继续进行培养，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。目前有使用防褐剂的相关研究，然而，防褐剂并非越多效果越好，不同种类和数量的防褐剂组合不恰当反而会影响植物本身生长，而且其他用途的物质加入可能会有难以预料的效果，值得探索。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供基于多物质组合的烟草外植体防褐化方法。本专利技术采用解决技术问题方案如下：一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；所述叶盘MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加5-12.5g/L氯化钙，2.5-7.5g/LD-异抗坏血酸钠，1-4g/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5-6。进一步地，步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。进一步地，步骤（2）中，MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。进一步地，步骤（4）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：A、D-异抗坏血酸钠的制备：称取D-异抗坏血酸钠溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/L的溶液；B、柠檬酸的制备：称取柠檬酸溶于无菌水中，在超净工作台中使用滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/L的溶液；C、配制1LMS防褐化培养基：将MS基本培养基4.43g，30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；D、防褐化培养基中添加防褐添加剂5-12.5g/L氯化钙，4g琼脂，121℃灭菌15min；E、灭菌后，添加2.5-7.5g/LD-异抗坏血酸钠，1-4g/L柠檬酸，摇匀，即得到MS防褐化培养基。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术添加D-异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙在培养基中，D-异抗坏血酸钠具有防褐化的作用，且成本较低，柠檬酸对于PPO的辅基铜离子有螯合作用，从而能有效抑制PPO的活性，来改善褐化现象。而氯化钙在一定浓度时能有效抑制酶活性的作用。同时添加这三种成分对缓解外植体褐化的现象，无需辅助其他防褐化手段。柠檬酸作为常用防褐剂，与抗坏血酸相比，D-异抗坏血酸钠也具有防褐化作用，且价格更低廉，氯化钙不常作为防褐剂，然而，三种物质组合使用却可以有效缓解外植体的褐化现象。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1本实施例的基于D-异抗坏血酸钠、柠檬酸和氯化钙组合的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成幼苗，所述种子MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体，所述叶盘MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤（4），防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中加入10g/L氯化钙、5g/LD-异抗坏血酸钠、2g/L柠檬酸，30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；MS防褐化培养基的制备方法如下：A、D-异抗坏血酸钠的制备：称取5gD-异抗坏血酸钠溶于100mL无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为50g/L的溶液。B、柠檬酸的制备：称取4gD-异抗坏血酸钠溶于100mL无菌水中，在超净工作台中使用0.22μm滤头过滤灭菌，制成浓度为40g/L的溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30‑50μmol/(m

【技术特征摘要】
1.一种多物质组合的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1），种子的消毒；步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于MS分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；所述叶盘MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖，4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7；步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加5-12.5g/L氯化钙，2.5-7.5g/LD-异抗坏血酸钠，1-4g/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5-6。2.根据权利要求1所述的多物质组...

【专利技术属性】
技术研发人员：向海英，蒋佳芮，许力，宋春满，张建铎，高茜，曾婉俐，张涛，邓乐乐，陈章玉，李雪梅，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53