一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法技术

技术编号:17748913 阅读:43 留言:0更新日期:2018-04-21 09:37
本发明专利技术公开了一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法,以3个基因型高度纯合的甘蓝DH株根段为外植体,研究甘蓝根系再生植株技术,为每个小孢子再生DH株当年快速扩繁群体创造条件。将不定芽根段接种到不同浓度6‑BA与NAA激素组合的MS分化培养基诱导芽苗的分化。根段在MS+0.03mg/LNAA+4.5mg/L 6‑BA+6mg/L AgNO3+0.1mg/LZnSO4的分化培养基中植株再生率高达90.0%;DH株根段再生植株所用的外植体最佳根龄是20天;不同DH材料的再生能力有显著差异。本发明专利技术为每个小孢子再生DH株当年快速扩繁群体创造条件,为提高DH系利用加快育种进程奠定基础。

A method to regenerate plants from the root of DH plant of Brassica oleracea

The invention discloses a method to regenerate plants from the root of DH plant of Brassica oleracea. The root of 3 highly homozygous DH plants of Brassica oleracea is used as explant to study the technology of Plant Regeneration from the root of Brassica oleracea, creating conditions for the rapid propagation of DH strains in each microspore regeneration. The adventitious bud segments were inoculated into MS differentiation medium with different concentrations of 6 BA and NAA hormone to induce differentiation of shoots. The plant regeneration rate of the root segment was up to 90% in the differentiated medium of MS+0.03mg/LNAA+4.5mg/L 6 BA+6mg/L AgNO3+0.1mg/LZnSO4, and the optimum root age for the explants used in the root segment of the DH plant was 20 days, and the regeneration ability of different DH materials was significantly different. The invention creates conditions for each microspore regeneration DH strain to expand rapidly in the year, so as to lay a foundation for improving the utilization of DH lines and speeding up the breeding process.

【技术实现步骤摘要】
一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法
本专利技术属于农业
,涉及一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法。
技术介绍
甘蓝(Brassicaoleracea)俗称卷心菜、包菜,是十字花科(Cruciferae)芸苔属(Brassica)植物,甘蓝具有适应性广、抗逆性强、容易栽培、产量高、耐运输、耐贮藏等优点。随着甘蓝产业的发展和人们生活水平的不断提高,甘蓝产业种植的品种更换年限极大缩短,来自国内和国外品种的市场竞争力显得尤为强劲。当今生产上的甘蓝品种要求品质更优、抗病性更强、商品性更好和产量更高的新品种,但甘蓝育种者仅靠传统的常规育种方法很难取得突破性进展,多目标的杂种优势品种选育往往滞后于产业发展。甘蓝游离小孢子培养技术研究和应用已成为现阶段突破甘蓝强优势多目标育种的瓶颈和加快甘蓝新品种选育的有效途径,该技术在短暂的1~2年就能快速创制出大批不同基因型聚集优势基因在一起的育种自交系,从而加快育种进程;但该技术中甘蓝游离小孢子来源大多来自杂种一代或低代自交系,理论上花蕾中每个小孢子的基因型存在极大差异。故此,花蕾小孢子再生植株间基因型具有不一致性,经高海娜、张恩慧、董韩等研究报道,每个小孢子只能再生一个胚状体,一个胚状体只能再生1~5个DH植株,这就易造成当代每个基因型小孢子群体过少,不易对DH植株农艺性状科学观察和用于配制新组合。据杨安平、马勇斌等研究报道,甘蓝小孢子试管再生植株根系较发达,次生根系生长旺盛。因而,利用小孢子再生植株根系扩繁DH株群体就成为更进一步加快甘蓝育种进程的重要研究目标。近年来国内外关于甘蓝离体再生体系建立的研究报道甚多,外植体多以植株地上部分茎叶和花器为主,但很少见到以植株地下部的根系,特别是未见到以DH植株根系段为外植体的再生体系的研究报道。甘蓝利用植株的子叶、下胚轴、茎、真叶和花蕾等作为外植体成功诱导出再生植株,技术已经较为成熟;利用根系仅见用杂种一代品种的根段再生植株,仅诱导出愈伤未见再生成苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法,以基因型高度纯合的甘蓝DH植株根系段为外植体,研究甘蓝DH植株根系再生植株技术,为每个小孢子再生DH植株当年快速扩繁群体创造条件,为提高DH系利用加快育种进程奠定基础。其具体技术方案为:一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法,包括以下步骤:步骤1、根系外植体培养栽培甘蓝三个优良杂种一代组合植株抽薹开花,选取单核靠边期的花蕾游离小孢子培养诱导再生植株,当胚状体诱导数个不定芽生长高度达3cm时,至基部切下转接生根培养基上培养再生DH植株,等不定芽诱导出的根生长不同天数后,将试管苗放置8~10℃光照培养箱炼苗5天,随后在超净工作台取出DH植株,无菌水冲洗净根部培养基,然后将一定粗度的根切下放到MS+8~12%蔗糖液体培养基浸泡5~8分钟,冲洗干净,切成1cm左右的根系段作为外植体。步骤2、根系再生植株培养方式与MS培养基适宜NAA浓度筛选选用DH植株即DH15-1A的根系为试材,将根系切成1cm左右长度的根段为外植体。采用二因子系统分组设计,共有两组变量,其一,将供试外植体分设为两组处理;一组处理即进行预培养,3d后转入共培养基中进行培养;另一组处理即直接进行共培养基中培养。其二,将共培养基中的NAA浓度设五个处理,即NAA浓度分别为0.045mg/L、0.03mg/L、0.025mg/L、0.018mg/L、0.015mg/L。预培养基为MS+1.0mg/L2,4-D+4.5mg/L6-BA,共培养基为MS+NAA+4.5mg/L6-BA+6mg/LAgNO3+0.1mg/LZnSO4。外植体接入三角瓶诱导培养,每个处理选用10个外植体,三次重复。培养温度25℃、光照强度为3000Lx、光照时数12h/d;比较分析DH植株根系再生植株的适宜培养方式、培养基和最适NAA浓度。步骤3、根系再生植株适宜根龄筛选选用DH植株即DH15-1A的根系为试材,待试管中DH15-1A植株长出可见根系时,开始计算根龄。根龄设15天、20天、25天共三个时间段处理,以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件,每个处理选用10个外植体,三次重复;比较分析甘蓝DH15-1A植株不同根龄再生植株诱导效果。步骤4、不同基因型DH植株根系诱导和植株再生选用DH15-1A、DH15-2B、DH15-3C等三种基因型的DH植株20天根系为试材,将根系切成1cm左右长度的根段为外植体。以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件,每个处理选用10个外植体,三次重复;比较分析不同基因型植株诱导效果。同时待不定芽长至2~3cm时,将芽从基部切下,转至生根培养基(MS+0.1mg/LNAA)上进行培养诱导成再生植株。步骤5、数据计算和处理愈伤诱导率=诱导出愈伤的外植体数/总外植体数×100%外植体诱导率=诱导不定芽外植体数/总外植体数×100%不定芽诱导率=诱导不定芽总数/总外植体数×100%植株再生率=再生植株数/接种总芽数×100%所得数据采用IBMSPSSstatistics20软件进行差异显著性分析,在0.05和0.01水平上进行多重比较分析。进一步,根段在MS+0.03mg/LNAA+4.5mg/L6-BA+6mg/LAgNO3+0.1mg/LZnSO4的分化培养基中植株再生率为90.0%;DH植株根段再生植株所用的外植体根龄是20天;不同DH材料的再生能力有显著差异。与现有技术相比,本专利技术的有益效果:本专利技术以3个基因型高度纯合的甘蓝DH植株根段为外植体,研究甘蓝DH株根系再生植株技术,为每个小孢子再生DH植株当年快速扩繁群体创造条件。1)最早对DH植株采用低温(T=8~10℃)炼苗处理和根切段放置MS+8~12%蔗糖液体培养基浸泡5~8分钟,促进根系再生。2)将不定芽根段接种到不同浓度6-BA与NAA激素组合的MS分化培养基诱导芽苗的分化。首次筛选出DH植株根段再生植株最适培养基,即MS+0.03mg/LNAA+4.5mg/L6-BA+6mg/LAgNO3+0.1mg/LZnSO4;根段在MS+0.03mg/LNAA+4.5mg/L6-BA+6mg/LAgNO3+0.1mg/LZnSO4的分化培养基中植株再生率高达90.0%。3)DH植株根段再生植株所用的外植体最佳根龄是20天;不同DH材料的再生能力有显著差异。再生苗经生根培养和驯化后,移栽田间可正常开花结果。本专利技术以基因型高度纯合的甘蓝DH株根系段为外植体,研究甘蓝DH株根系再生植株技术,为每个小孢子再生DH植株当年快速扩繁群体创造条件,为提高DH系利用加快育种进程奠定基础。附图说明图1A:根段培养1周时形成愈伤组织;图1B:根段培养10天形成愈伤组织;图1C:根段培养2周形成愈伤组织;图1D:根段愈伤组织形成芽点;图1E:根段培养4周愈伤组织分化叶片;图1F:根段培养6周愈伤组织分化叶片和根。图2A:DH植株根段接种添加0.03mg/LNAA共培养基培养3周后分化丛生芽;图2B:DH植株根段接种添加0.025mg/LNAA共培养基培养3周后分化丛生芽;图2C:DH植株根段接种添加0.018mg/LNAA共培养基培养3周后分化丛生芽;图3:三柱形本文档来自技高网
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一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法

【技术保护点】
一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1、根系外植体培养栽培甘蓝三个优良杂种一代组合植株抽薹开花,选取单核靠边期的花蕾游离小孢子培养诱导再生植株,当胚状体诱导数个不定芽生长高度达3cm时,至基部切下转接生根培养基上培养再生DH植株,等不定芽诱导出的根生长不同天数后,将试管苗放置8~10℃光照培养箱炼苗5天,随后在超净工作台取出DH植株,无菌水冲洗净根部培养基,然后将一定粗度的根切下放到MS+8~12%蔗糖液体培养基浸泡5~8分钟,冲洗干净,切成1cm的根系段作为外植体;步骤2、根系再生植株培养方式与MS培养基适宜NAA浓度筛选选用DH植株即DH15‑1A的根系为试材,将根系切成1cm长度的根段为外植体;采用二因子系统分组设计,共有两组变量,其一,将供试外植体分设为两组处理;一组处理即进行预培养,3天后转入共培养基中进行培养;另一组处理即直接进行共培养基中培养;其二,将共培养基中的NAA浓度设五个处理,即NAA浓度分别为0.045mg/L、0.03mg/L、0.025mg/L、0.018mg/L、0.015mg/L;预培养基为MS+1.0mg/L2,4‑D+4.5mg/L 6‑BA,共培养基为MS+NAA+4.5mg/L6‑BA+6mg/L AgNO3+0.1mg/LZnSO4;外植体接入三角瓶诱导培养,每个处理选用10个外植体,三次重复;培养温度25℃、光照强度为3000Lx、光照时数12h/d;比较分析DH植株根系再生植株的适宜培养方式和最适NAA浓度;步骤3、根系再生植株适宜根龄筛选选用DH植株即DH15‑1A的根系为试材,待试管中DH15‑1A植株长出能见根系时,开始计算根龄;根龄设15天、20天、25天共三个时间段处理,以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件,每个处理选用10个外植体,三次重复;比较分析甘蓝DH15‑1A植株不同根龄再生植株诱导效果;步骤4、不同基因型DH植株根系诱导和植株再生选用DH15‑1A、DH15‑2B、DH15‑3C三种基因型的DH植株20天根系为试材,将根系切成1cm长度的根段为外植体;以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件,每个处理选用10个外植体,三次重复;比较分析不同基因型植株诱导效果;同时待不定芽长至2~3cm时,将芽从基部切下,转至生根培养基MS+0.1mg/L NAA上进行培养诱导成再生植株;步骤5、数据计算和处理愈伤诱导率=诱导出愈伤的外植体数/总外植体数×100%外植体诱导率=诱导不定芽外植体数/总外植体数×100%不定芽诱导率=诱导不定芽总数/总外植体数×100%植株再生率=再生植株数/接种总芽数×100%所得数据采用IBM SPSS statistics 20软件进行差异显著性分析,在0.05和0.01水平上进行多重比较分析。...

【技术特征摘要】
1.一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1、根系外植体培养栽培甘蓝三个优良杂种一代组合植株抽薹开花,选取单核靠边期的花蕾游离小孢子培养诱导再生植株,当胚状体诱导数个不定芽生长高度达3cm时,至基部切下转接生根培养基上培养再生DH植株,等不定芽诱导出的根生长不同天数后,将试管苗放置8~10℃光照培养箱炼苗5天,随后在超净工作台取出DH植株,无菌水冲洗净根部培养基,然后将一定粗度的根切下放到MS+8~12%蔗糖液体培养基浸泡5~8分钟,冲洗干净,切成1cm的根系段作为外植体;步骤2、根系再生植株培养方式与MS培养基适宜NAA浓度筛选选用DH植株即DH15-1A的根系为试材,将根系切成1cm长度的根段为外植体;采用二因子系统分组设计,共有两组变量,其一,将供试外植体分设为两组处理;一组处理即进行预培养,3天后转入共培养基中进行培养;另一组处理即直接进行共培养基中培养;其二,将共培养基中的NAA浓度设五个处理,即NAA浓度分别为0.045mg/L、0.03mg/L、0.025mg/L、0.018mg/L、0.015mg/L;预培养基为MS+1.0mg/L2,4-D+4.5mg/L6-BA,共培养基为MS+NAA+4.5mg/L6-BA+6mg/LAgNO3+0.1mg/LZnSO4;外植体接入三角瓶诱导培养,每个处理选用10个外植体,三次重复;培养温度25℃、光照强度为3000Lx、光照时数12h/d;比较分析DH植株根系再生植株的适宜培养方式和最适NAA...

【专利技术属性】
技术研发人员:张恩慧李楠武习习尹盼盼许忠民杨安平
申请(专利权)人:西北农林科技大学
类型:发明
国别省市:陕西,61

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