用于评估含亚锡的口腔护理产品的荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一种定量生物膜(2005)的微生物细胞的亚锡吸附的方法，该方法为评估含有亚锡的口腔护理产品的功效的有效途径。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于评估含亚锡的口腔护理产品的荧光探针
本公开涉及用于评估含亚锡的口腔护理产品的方法。
技术介绍
已经大致描述了定量口腔护理产品(例如牙膏、漱口水等等)对从生物膜测试表面上去除细胞或者抑制或延缓细胞在测试表面上积聚的功效的方法。另外，荧光探针和共焦激光扫描显微镜法(confocallaserscanningmicroscopy，CLSM)已经一般用于评估生物膜的细菌活力。已经将亚锡(Sn2+)添加到口腔护理产品中以预防牙菌斑和口腔疾病。发现Sn2+有效地抑制在人邻面牙菌斑中能够引起蛀牙的某些细菌。然而，需要一种用于给含亚锡的口腔护理产品的性能及其对生物膜的抑菌或杀菌功效定量的特定方法。
技术实现思路
本专利技术通过提供一种定量生物膜的微生物细胞的亚锡吸附的方法来满足这些需求中的至少一个，该方法包括以下步骤：用含亚锡的口腔护理产品处理生物膜；用微生物荧光探针标记生物膜；用亚锡荧光探针标记生物膜；以及通过例如共焦激光扫描显微镜法测量带标记的细胞发出的荧光来定量带标记的细胞。本专利技术的另一方面提供一种试剂盒，该试剂盒包含：微生物荧光探针；亚锡荧光探针；以及任选地使用说明书。本专利技术部分基于以下令人惊讶的发现：某些亚锡探针可用于定量生物膜的微生物细胞的亚锡吸附。本专利技术方法的一个优点在于能够确定亚锡和微生物探针的不同颜色荧光和在生物膜细菌中的探针共定位。本专利技术的另一个优点在于该方法可用于鉴别更有效的口腔护理组合物，因为这些组合物涉及生物膜中的亚锡递送和/或功效。本专利技术的另一个优点在于该方法可用于向消费者和牙科从业人员展示含亚锡的口腔产品如何起作用，因为这些产品涉及生物膜中的亚锡递送和/或功效。对于本领域的技术人员而言，通过阅读本公开，特定实施方案的这些和其它特征、方面和优点将变得显而易见。附图说明附图中描述的实施方案本质上为例示性的，并不旨在限制由权利要求书所限定的本专利技术。当结合以下附图阅读时，能够理解对以下例示性实施方案的详细描述，其中用类似的参考标号指示类似的结构，并且其中：图1为带有附接到其上的羟基磷灰石圆盘的咬合夹板的透视图；图2为其中具有沟槽的羟基磷灰石圆盘的透视图；图3为其中带有生物膜的沟槽的示意性剖视图；图4为提供对于几种含亚锡的牙膏和阴性对照，细菌(生物膜的细菌)中亚锡的共定位百分比的柱状图；图5为如何确定细菌中亚锡的共定位百分比和亚锡重叠系数的示意性示例；并且图6为提供在生物膜上的含亚锡膏料随时间推移的重叠系数的柱状图。具体实施方式以下文字阐述了本公开的多个不同实施方案的广义说明。本说明被理解为仅为示例性的，并非描述每一种可能的实施方案，因为描述每一种可能的实施方案即使可能也是不切实际的。应当理解，本文所述的任何特征、特性、组分、组成、成分、产品、步骤或方法均可被删掉、整个或部分地与本文所述的任何其它特征、特性、组分、组合物、成分、产品、步骤或方法相组合或由后者取代。可使用当前技术或在本专利的提交日期之后开发的技术来实施众多另选的实施方案，所述另选的实施方案将仍然落在本权利要求书的范围内。本公开的一个方面涉及一种定量生物膜的微生物细胞的亚锡吸附的方法，该方法包括以下步骤：用含亚锡的口腔护理产品处理生物膜；用微生物荧光探针标记生物膜；用亚锡荧光探针标记生物膜；以及通过共焦激光扫描显微镜法(CLSM)测量带标记的细胞发出的荧光来定量带标记的细胞。这些步骤不需要以特定的顺序进行。用含亚锡的口腔护理产品处理生物膜术语“生物膜”是指附连到一个表面上的一个或多个层。生物膜可包括活的且正在生长的微生物细胞以及死亡的微生物细胞。生物膜可由一种细胞类型构成，或者它可由两种或更多种细胞类型构成，诸如例如为多菌种细菌群落的生物膜复合物。一种特定类型的生物膜为牙斑生物膜(即，通常在人口腔中的牙齿表面上形成的生物膜)。牙斑生物膜中的细菌具有明显不同的生理特征，例如提高的洗涤剂和抗生素抗性，使得生物膜研究高度重要。口腔菌种的非限制性列表描述于美国专利6,309,835B1，第7栏，第12-30行中。生物膜可为体外生物膜或原位生物膜。优选地，生物膜为原位牙斑生物膜，因为它通过提供天然且未分布的生物膜更精确地反映人口腔状况。使其自身良好地适于评估生物膜中经限定时间段的亚锡保持的一种方法为使用原位牙斑生物膜。设想生物膜可附连的多个不同表面。这些表面可包括例如人釉质、牛釉质、牛牙质、羟基磷灰石、抛光玻璃和钛。考虑到基材表面的粗糙度及其自由能为牙斑生物膜原位生长的重要因素，釉质或羟基磷灰石为用于模拟牙斑生物膜生长的天然基材的优选表面。另一方面，由于已知的釉质自体荧光，对于牙斑生物膜的原位生长，羟基磷灰石是更优选的。羟基磷灰石也称为羟磷灰石(“HA”)，其为一种磷灰石钙质的矿物质形式，一般具有式Ca10(PO4)6(OH)2。在特别优选的方法中，使用含有HA的片(例如小圆盘)。这些HA片是相对小的，优选地具有7mm3至110mm3，优选地25mm3至35mm3的总体积。设计HA片具有多个沟槽(以允许牙斑生物膜附连在沟槽内部)。为清楚起见，原位或体外牙斑生物膜可用于附连到沟槽内部，但是原位牙斑生物膜是优选的。多个沟槽优选地具有以下尺寸：50um至500um深以及50um至500um宽，更优选地100um至400um深以及100um至400um宽，甚至更优选地沟槽中的至少一个为250um至350um深以及250um至350um宽。不受理论的束缚，许多人类受检者不介意佩戴口腔器具(含有这些HA片)超过二至三天。由于沟槽小于这些尺寸，沟槽充满原位牙斑生物膜，从而不允许受检者口腔护理产品和/或荧光探针渗入沟槽。另一方面，如果沟槽尺寸过大，则沟槽自身不良好地适于生物膜生长或附接，特别是如果人类受检者将仅佩戴口腔器具两至三天时。此外，这些优选的沟槽尺寸提供常规CLSM提供最佳的剖视图。在一个具体示例中，并且转向图2，HA圆盘(201)具有三个平行沟槽(203)(两侧的沟槽(203a和203c)为300um宽以及300um深；而中间沟槽(203b)(在两侧沟槽之间)为500um宽以及500um深)。将中间沟槽设计得比两侧沟槽更宽且更深，使得HA圆盘能够较容易地分成两个相同的半圆盘，用于头对头比较目的。图3为其中带有生物膜(2005)的沟槽(2003)的示意性剖视图。优选地，由于HA片附接到人类受检者佩戴的口腔器具(例如口腔分体器或口腔件)上限定的时间段，导致原位牙斑生物膜附接到HA片的表面上。该限定的时间段优选地为6小时至4天，更优选地1天至3天，另选地约2天。因此，该方法可包括以下步骤：使人类受检者佩戴口腔器具6小时至4天，优选地1-3天，更优选地2天；其中所述口腔器具的至少一部分包含HA作为生物膜的表面，并且其中生物膜为原位牙斑生物膜。术语“口腔器具”是指可每次被暂时佩戴在人类受检者的口腔(即，嘴部)内很多天的装置(但是在进食或口腔卫生等期间被暂时移除)。口腔器具的非限制性示例包括口腔分体器、口腔件和保持器。口腔器具优选地具有可释放地附接到其上的多个含HA的片(例如小圆盘)。换句话讲，人类受检者佩戴口腔器具，致使生物膜附连/生长到HA圆盘的表面和沟槽上。在6小时至4天，优选地2-3天，更优选地2天后，HA圆盘通过人类受检者佩戴的口腔器具移除。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量生物膜的微生物细胞的亚锡吸附的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用含亚锡的口腔护理产品处理所述生物膜；(b)用微生物荧光探针标记所述生物膜；(c)用亚锡荧光探针标记所述生物膜；以及(d)通过测量带标记的细胞发出的荧光来定量所述带标记的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种定量生物膜的微生物细胞的亚锡吸附的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用含亚锡的口腔护理产品处理所述生物膜；(b)用微生物荧光探针标记所述生物膜；(c)用亚锡荧光探针标记所述生物膜；以及(d)通过测量带标记的细胞发出的荧光来定量所述带标记的细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述通过测量带标记的细胞发出的荧光来定量带标记的细胞的步骤是通过共焦激光扫描显微镜法(CLSM)来进行的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述用微生物荧光探针和亚锡荧光探针标记生物膜的步骤在所述用含亚锡的口腔护理产品处理生物膜的步骤之前。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物膜为原位牙斑生物膜。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：使人类受检者佩戴口腔器具6小时至4天，优选地1-3天；其中所述口腔器具的至少一部分包含羟基磷灰石(HA)作为所述生物膜的表面，优选地所述生物膜为原位牙斑生物膜，优选地所述HA在所述口腔器具的颊侧上。6.根据权利要求5所述的方法，其中用所述含亚锡的口腔护理产品体外处理所述在HA表面上的原位生物膜。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述口腔器具的包含HA的部分还包含多个沟槽，其中所述沟槽的内表面为所述原位生物膜的所述表面，优选地至少一个沟槽为250微米至350微米深以及250微米至350微米宽。8.根据权利要求4所述的方法，其中用所述含亚锡的口腔护理产品处理所述原位牙斑生物膜为体内处理。9.根据权利要求4所述的方法，其中用所述含亚锡的口腔护理产品处理所述原位牙斑生物膜为体外处理。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物荧光探针为荧光标记的rRNA-引导的寡核苷酸。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亚锡荧光探针选自：(a)(3',6'-二氨基-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯；(b)(3',6'-双(二甲基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯；(c)(3',6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯；(d)(3',6'-双(乙基氨基)-2',7'-二甲基-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-呫吨]-2-基)氨基甲酸叔丁酯；(e)(3',6'-二氨基-2',7'-二甲基-3-氧代螺[异吲...

【专利技术属性】
技术研发人员：史运明，R·斯特兰德，常金兰，T·何，D·J·小怀特，贺艳焱，M·L·巴克，董维理，
申请(专利权)人：宝洁公司，
类型：发明
国别省市：美国,US