镰刀菌毒素脱毒路径相关基因ADH、AKR6D1、AKR13B2及其应用制造技术

本发明专利技术公开了镰刀菌毒素脱毒路径的相关基因

Genes related to detoxification of Fusarium toxin ADH, AKR6D1, AKR13B2 and their application

The present invention discloses the related genes of the detoxification path of Fusarium oxysporum

【技术实现步骤摘要】
镰刀菌毒素脱毒路径相关基因ADH、AKR6D1、AKR13B2及其应用
本专利技术属于食品安全中的真菌毒素脱毒领域，具体涉及镰刀菌毒素脱毒路径相关基因ADH、AKR6D1和AKR13B及其应用。ADH基因编码的蛋白质被证实能够作用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，将其氧化形成3-酮基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-oxo-DON)，同时AKR6D1、AKR13B2蛋白可以还原3-oxo-DON，形成毒性极弱的3-异构体-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-epi-DON)。
技术介绍
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种广泛分布的真菌毒素，主要由镰刀菌属真菌产生。这些产毒真菌在田间侵染小麦、大麦、玉米等禾谷类作物的小花组织，并定植在发育的籽粒上。因此，这些真菌产生的毒素会直接积累在成熟的谷物中，从而进入下游产品(Bai,G.,andShaner,G.ManagementandresistanceinwheatandbarleytoFusariumheadblight.2004.AnnuRevPhytopathol42:135-161.)。世界多地的谷物及其谷类早餐食品、烘焙产品、休闲食品、啤酒以及谷物制成的动物饲料中，均存在不同程度的真菌毒素污染(Desjardins2006，Lancovaetal.2008)。DON毒素耐高温，加热不易降解，可在食物链中长期存留，严重危害人畜健康。摄食DON污染的食物会导致人的免疫力低下、贫血、头痛、恶心及腹痛等，动物摄食后可导致拒食、呕吐、生长阻滞及生殖紊乱等(Pestka,J.J.Deoxynivalenol:mechanismsofaction,humanexposure,andtoxicologicalrelevance.2010.ArchToxicol84:663-679.)。在植物中，极低剂量的毒素即可引起多种植物枯萎、蔫黄、坏死等症状；同时DON作为一种毒力因子，能够促进镰刀菌在小麦穗部的扩散从而加重赤霉病病症，严重降低作物产量(Bai等,Deoxynivalenol-nonproducingFusariumgraminearumcausesinitialinfection,butdoesnotcausediseasespreadinwheatspikes.2002.Mycopathologia.153:91-98)。由于我国农业生态环境及耕作制度引起的镰刀菌毒素污染面大，迄今国内外又缺乏控制或消除DON毒素的有效方法，所以时常发生人误食受镰刀菌毒素污染面粉而中毒的事件，尤其是DON毒素对猪、鸡等动物的影响巨大，既严重阻滞动物生长，DON毒素在动物产品中的残留又影响人类健康。因此，寻找消除DON毒性的材料和方法，是人类面临的一个重要任务。利用微生物靶向改变DON毒性基团的生物脱毒方法，是目前毒素降解研究的热点及研究发展方向。这种方法相对于物理脱毒及化学脱毒方法，具有特异性强、环境安全、脱毒效率高等特点；同时，自然界微生物资源丰富，因此，开发利用微生物资源来进行镰刀菌毒素的生物脱毒，具有开发应用前景。目前已有几个具有生物脱毒活性的微生物菌株被分离，它们能够靶向改变DON的毒性基团从而大大降低DON的毒性(Karlovsky,P.Biologicaldetoxificationofthemycotoxindeoxynivalenolanditsuseingeneticallyengineeredcropsandfeedadditives.2011.ApplMicrobiolBiotechnol91:491-504.)。Devosiasp.17-2-E-8等菌株能够将DON转化为3-异构-DON(3-epi-DON)，动物毒理实验及分子生物学研究表明，3-epi-DON的毒性相对于DON的毒性下降了1181倍，基本上已经没有毒性(He等,Toxicologyof3-epi-deoxynivalenol,adeoxynivalenol-transformationproductbyDevosiamutans17-2-E-8.2015.FoodChemToxicol84:250-259.)。Sphingomonassp.KSM1菌株能够降解DON产生16-羟基-DON(16-HDON)，后者的植物毒性是DON的1/10(Ito等，BacterialcytochromeP450systemcatabolizingtheFusariumtoxindeoxynivalenol.2013.ApplEnvironMicrobiol79:1619-1628.)。因此，将DON毒素转化为几乎没有毒性的3-异构-DON(3-epi-DON)，被认为是到目前为止最为有效的脱毒途径。然而，DON降解成为3-epi-DON的代谢路径以及涉及的相关基因仍然未知。醛酮还原酶(Aldo-ketoreductases,AKRs)是一个包括17个家族190多个成员的超家族，广泛分布于原核生物、原生动物、酵母、植物、动物以及人类。不同家族成员之间的氨基酸序列同源性低于40％，而同一家族内的不同成员之间氨基酸序列同源性高于60％。大多数AKR以单聚体形式存在，分子量在34-37kDa之间。这些酶具有多种多样的功能，多种研究表明它们参与了生物体内内源和外源有毒物质的代谢过程。来源于人和小鼠的AKR7A相关成员参与了体内的黄曲霉代谢过程，保护机体免受黄曲霉诱导的肝脏毒性(Penning,Thealdo-ketoreductases(AKRs):Overview.2005.ChemBiolInteract234:236-246.)。专利技术人从土壤中分离获得一株具有脱毒活性的德沃斯氏菌属(Devosiasp.)的细菌菌株D6-9，能将DON转化为3-异构-DON(3-epi-DON)，对其进行基因组测序，通过基因组比较分析发现这个转化过程涉及3个基因，分别是ADH、AKR6D1和AKR13B2基因。通过原核表达的融合蛋白体外转化实验表明，ADH基因编码的蛋白质被证实能够作用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，将其氧化形成3-酮基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-oxo-DON)，进一步由AKR6D1、AKR13B2蛋白还原3-oxo-DON，形成3-异构体-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-epi-DON)。这些实验结果证明，ADH、AKR6D1和AKR13B2就是将DON毒素转化为无毒的3-epi-DON的一组基因，利用这3个基因，就可以有效清除DON毒素的毒性，从而保障粮食、食品安全，以及粮食高产稳产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供从德沃斯氏菌(Devosiasp.)D6-9中分离克隆的与镰刀菌毒素脱毒路径相关的3个基因ADH、AKR6D1、AKR13B2，核苷酸序列如SEQNO.1-3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4-6所示。本专利技术的另一个目的在于提供基因ADH、AKR6D1、AKR13B2的制备方法，利用所述的特异性引物进行PCR扩增，分别获得ADH、AKR6D1、AKR13B2的基因序列，操作简单，产物特异。本专利技术的再一个目的在于提供基因ADH、AK本文档来自技高网...

【技术保护点】
镰刀菌毒素脱毒路径相关基因，其特征在于，包括基因ADH、AKR6D1、AKR13B2，基因ADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，基因AKR6D1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，基因AKR13B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

【技术特征摘要】
1.镰刀菌毒素脱毒路径相关基因，其特征在于，包括基因ADH、AKR6D1、AKR13B2，基因ADH的核苷酸序列如SEQIDNO.1，基因AKR6D1的核苷酸序列如SEQIDNO.2，基因AKR13B2的核苷酸序列如SEQIDNO.3。2.权利要求1所述的镰刀菌毒素脱毒路径相关基因编码的蛋白质，其特征在于，基因ADH编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示，基因AKR6D1编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示，基因AKR13B2编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示。3.权利要求1所述镰刀菌毒素脱毒路径相关基因的扩增引物，其特征在于，基因A...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉才，何伟杰，李和平，易沭远，张静柏，黄涛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42