本发明专利技术公开了一种能识别玉米赤霉烯酮及其代谢产物的特异性单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株ZEN/6C2所分泌的，所述的杂交瘤细胞株ZEN/6C2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201781。本发明专利技术还公开了检测玉米、猪饲料、动物可食性组织和牛奶中玉米赤霉烯酮及其代谢产物的酶联免疫方法及其试剂盒。本发明专利技术制备的单克隆抗体灵敏度较高，广谱，检测的准确度高，精密度好，具有简便、快速、易操作等有点。
Monoclonal antibody and enzyme linked immunosorbent assay and kit for detection of zearalenone and its metabolites
The invention discloses a specific monoclonal antibody can identify zearalenone and its metabolites. It is secreted by the hybridoma cell line ZEN/6C2, the hybridoma cell line ZEN/6C2, preservation of culture collection in Chinese typical preservation number is CCTCC NO: C201781. The invention also discloses an enzyme-linked immunosorbent assay for detecting zearalenone and its metabolites in corn, pig feed, animal edible tissue and milk, and a kit. The monoclonal antibody prepared by the invention has high sensitivity, wide spectrum, high accuracy and precision, and is simple, fast, easy to operate, and so on.
【技术实现步骤摘要】
用于检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单抗及酶联免疫方法与试剂盒
本专利技术属于兽药残留分析和免疫学
，具体涉及一种能识别玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单克隆抗体以及酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。
技术介绍
玉米赤霉烯酮(ZEN)是黄色镰刀菌和禾谷镰刀菌等镰刀菌属真菌的次级代谢产物，主要污染玉米、小麦、大米、大麦、及燕麦等谷物。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于雌性动物生殖系统，引起繁殖机能异常甚至死亡，具有基因毒性和致癌性，免疫毒性及生殖毒性。欧盟规定未加工谷物(不包括玉米)、面包以及婴儿食品中ZEN的最大残留限量分别为100、50.0、20.0μgkg-1。中国则规定小麦及玉米中ZEN最大残留限量为60.0μgkg-1。动物摄入玉米赤霉烯酮后，可将其代谢为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇以及玉米赤霉酮，而玉米赤霉烯醇同样存在于谷物中。由于这些代谢物均具有较强的雌激素活性，故α-玉米赤霉醇曾被广泛用作牛羊促生长剂，但因其能影响人体生殖系统发育，欧盟禁止将其用于动物源食品，我国也禁止将其用于食品动物促生长作用。残留检测方法是准确判断残留是否超标的重要手段，要求具有较高的精确度和准确度。目前用于玉米赤霉烯酮类霉菌毒素检测的方法主要有仪器分析法和免疫学检测方法。仪器分析法具有检测灵敏度高、选择性好、分离效率高和应用范围广等优点，能够满足大多数霉菌毒素的检测要求。但该类方法通常需要昂贵的仪器设备，对操作人员的技术要求较高，需要进行复杂的分析，更适用于对药物的确认检测而不适用于样品的大量筛选。免疫学检测方法，尤其是ELISA方法，具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，能够克服仪器分析的缺陷，是一种有效的大批量残留筛选方法，有着巨大的发展前景。虽然目前基于单抗的玉米赤霉烯酮类霉菌毒素ELISA方法已有报道，但抗体灵敏度低、广谱性差、检测样品种类单一，使得该类方法的应用受到一定局限。
技术实现思路
本专利技术的目的为：(1)提供一种特异性识别玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单克隆抗体；(2)提供所述单克隆抗体在制备检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的酶联免疫试剂盒中的应用；(3)利用该单克隆抗体，建立一种能检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的ELISA方法；(4)提供所述酶联免疫检测试剂盒在玉米赤霉烯酮及其代谢产物检测中的应用。上述目的是通过以下技术方案实现的：一种单克隆抗体，能识别玉米赤霉烯酮及其代谢产物，它是由保藏号为CCTCCNO:C201781的杂交瘤细胞株ZEN/6C2所分泌的。所述代谢产物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮。所述的杂交瘤细胞株ZEN/6C2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201781。它是以玉米赤霉烯酮(ZEN)与NH3反应生成半抗原(7-NH2-ZEN)，再将7-NH2-ZEN与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛(GA)方法偶联得到偶联物(7-NH2-ZEN-GA-BSA)，该偶联物作为免疫原免疫动物后制备得到的。所述半抗原的结构式如下：所述的单克隆抗体在制备检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的酶联免疫试剂盒中的应用。包含所述的单克隆抗体的试剂盒，所述的试剂盒是检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的酶联免疫试剂盒。所述的试剂盒在玉米赤霉烯酮及其代谢产物的非诊断目的检测中的应用。一种玉米赤霉烯酮及其代谢产物非诊断目的检测的酶联免疫方法，包括以下步骤：(1)将结构式如下的半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)偶联得到包被原；(2)用保藏号为CCTCCNO:C201781的杂交瘤细胞株ZEN/6C2制备单克隆抗体；(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；(4)玉米、猪饲料、动物可食性组织如猪肉、肝、肾、牛奶样品的处理和检测。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术在制备单克隆抗体时，以玉米赤霉烯酮肟为半抗原，将半抗原与载体蛋白偶联作为免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体能特异性同时识别玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮；2.本专利技术的酶联免疫试剂盒和方法适用于检测玉米、猪饲料、动物可食性组织、牛奶中玉米赤霉烯酮及其代谢产物的残留，检测的灵敏度、准确度高，精密度好，玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的IC50值分别为114.0、127.4、290.4、114.9、205.6和257.1ngL-1，本专利技术的ELISA方法广谱、灵敏度、准确度高，精密度好；3.本专利技术所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者要求低，身体健康危害相对较小。附图说明图1为玉米赤霉烯酮(ZEN)的间接竞争ELISA标准曲线。图2为α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)的间接竞争ELISA标准曲线。图3为β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL)的间接竞争ELISA标准曲线。图4为α-玉米赤霉醇(α-ZAL)的间接竞争ELISA标准曲线。图5为β-玉米赤霉醇(β-ZAL)的间接竞争ELISA标准曲线。图6为玉米赤霉酮(ZAN)的间接竞争ELISA标准曲线。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。实施例1免疫原和包被原的制备1.1免疫原7-NH2-ZEN-GA-BSA的制备准确称取2mgZEN溶于1mL甲醇，冰浴条件下通入氨气，室温搅拌反应1h，加入3mg氰基硼氢化钠，继续搅拌反应3h。室温下氮气吹干即得半抗原7-NH2-ZEN。将半抗原溶于100μLDMF，称取16.0mgBSA溶于4mLPBS，将两者缓慢混匀得A液。取40μL25％戊二醛溶液，以PBS稀释至400μL，此为B液。避光条件下将B液逐滴加入到A液，室温搅拌反应9h。将反应液在4℃条件下用pH＝7.4的PBS透析5d，5000rmin-1离心10min，保留上清，即得7-NH2-ZEN-GA-BSA，于-20℃保存备用。反应如下：1.2包被原ZEN-CMO-OVA的制备准确称取2mgZEN，溶于1mL甲醇，加入3mg羧甲基羟胺半盐酸盐和5mg无水碳酸钠，室温条件下搅拌反应24h，将所得溶液用氮吹仪进行氮吹，吹干后加入0.05molL-1的盐酸2mL复溶，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，弃去水相，合并有机相，进行氮吹，吹干后得淡黄色油状残留物，即半抗原ZEN-CMO。称取1mg半抗原(ZEN-CMO)，溶于400μLDMF中，加入1mgNHS和2mgEDC，室温条件下搅拌反应过夜得A液。称取16.0mgOVA缓慢溶于4mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，此为B液。冰浴条件下，将A液逐滴缓慢加入B液，搅拌反应过夜。将反应液在4℃条件下用pH＝7.4的PBS透析3d，5000rmin-1离心10min，保留上清，即得ZEN-CMO-OVA，于-20℃保存备用。反应如下：实施例2单克隆抗体的制备2.1动物免疫利用制备的免疫原(7-NH2-ZEN-GA-BSA)免疫雌性Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)。免疫程序是取免疫原7-NH2-ZEN-GA-BSA以蛋白含量分别为100μg和50μg与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。2.2细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能识别玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201781的杂交瘤细胞株ZEN/6C2所分泌的。
【技术特征摘要】
1.一种能识别玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO:C201781的杂交瘤细胞株ZEN/6C2所分泌的。2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于：所述代谢产物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮。3.如权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述杂交瘤细胞株ZEN/6C2，它是将半抗原与载体蛋白偶联后作为免疫原制备得到的，所述半抗原的结构式如下：4.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的酶联免疫试剂盒中的应用。5.包含权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭大鹏，袁宗辉，董国良，王玉莲，潘源虎，陈冬梅，陶燕飞，刘振利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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